二代测序原理（Illumina）

莺歌燕舞

虽然三代测序现在已经商用，但是目前的主流还是二代测序，尤其是Illumina公司的测序方式更是大行其道。那么，下面我们从四个方面来说说illumina家的二代测序是怎么得到的生物数据。

• 样本准备 Sample Prep
  
• 成簇 Cluster Generation
  
• 测序 Sequencing
  
• 数据分析 Data Analysis
  

0、二代测序基本原理

基于可逆终止的，荧光标记dNTP，做边合成边测序
1、样本准备 Sample Prep

通过不同实验方法得到的样品，需要先提取样本基因组中的DNA，用超声波将其随机打断。
然后使用酶将两端补平，使用 Klenow 酶在3‘ 端加一个 A 碱基（用于连接接头序列）。
为了后续扩增，测序分析，需要为这些DNA片段添加特定的接头序列（已知的，用于测序识别），大概有三种：

• sequencing binding site（绿）
  
• index（红，黄）
  
• 流动池引物互补的序列（蓝，紫）
  

添加完接头序列后的DNA片段集合叫DNA文库 （DNA library），这样就完成了样品准备工作。
2、成簇 Cluster Generation

成簇是DNA片段被扩增的过程，该过程在流动池 (Flowcell) 中完成。它是一片带有8条通道（lanes）的玻璃载玻，每个通道内表面附有两种DNA引物。



首先，引物会与样品中的DNA片段的接头序列互补配对，固定在通道表面



通过聚合酶生成杂交片段的互补片段，然后加入NaOH碱溶液后，双链分子变性，原始模板链（左边的链）被流动池中的液体洗去



加入中性液体用于中和碱溶液，剩下的单链拷贝链另一端的接头就会与通道表面的引物结合，形成单链桥。



同样的，在聚合酶参与下，生成互补链，最终形成双链桥



通过变性，DNA分子线性化，变为两个单链拷贝



它们又分别与自己配对的引物结合



重复这个循环，同时形成数百万的簇。在这个过程中，所有的DNA片段都会被克隆扩增。



桥式扩增后，反向链会被切断洗去，仅留下正向链。为防止特异性结合重新形成单链桥，3‘端被封锁



3、测序 Sequencing

首先，在Flowcell中加入荧光标记的dNTP和酶，由引物起始开始合成子链。
但是dNTP存在 3’端叠氮基会阻碍子链延伸，这使得每个循环只能测得一个碱基。
合成完一个碱基后， Flowcell 通入液体洗掉多余的dNTP和酶，使用显微镜的激光扫描特征荧光信号。



荧光发射波长与信号强度一起决定了碱基的读出，所有的DNA片段的一个碱基会被同时读取。在大规模并行的过程中，机器读取的图像类似下面这样



加入化学试剂将叠氮基团与荧光基团切除，然后 Flowcell 再通入荧光标记的dNTP和酶，由引物起始开始合成一个碱基。不断重复这个过程，完成第一次读取。
由于测序仪每次测序时的通量比较大，所以每次测得的序列可能不止一个样本。
为了去区分每个样本及正负链，科学家构建DNA文库时，在接头序列加入了的不同 index（或 barcode）来区分来源。
首先，在完成第一次读取后，复制出的链会被洗去



index 片段引物被引入并与模板杂交，完成序列读取后被洗去。这样读取到的序列与开始时已知的index比对后就可以给测得的序列贴上标签，方便后续分析。



Paired-end测序已经是现在的主流，它提高了测序长度的同时，又可以为结构变异分析提供新方法。要完成双末端测序，首先要将模板链3’去保护，模板折叠，index片段引入



在聚合酶参与下形成双链桥



然后变性，恢复为单链。注意，这次是将正向链切除并洗去，只留下反向链



反向链以测序引物为起始，与正向链类似，经过多个循环后完成读取。



4、数据分析 Data Analysis
测序完成后会产生数百万个 reads，基于在样品准备时构建的 index 分类来自不同样本的序列。对于每个样品来说，具有相似延伸的碱基被聚在一起。正向和反向read配对生成连续序列。这些序列通过与参考基因组匹配后，实现完整序列的构建。

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