为什么CRISPR-Cas9容易脱靶？

奋斗的小鸟

为什么CRISPR-Cas9容易脱靶？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/333911099

队长是我

由于sgRNA配对结合区域碱基有限，也许能够配对的DNA片段在基因组里有数个，但如果把sgRNA的定位区设计过长，则有一部分会被剪掉，失去功能。并且在局部不配对的情况下，sgRNA的定位区也有可能与相似的DNA序列结合，导致切割错误的基因。sgRNA(crRNA)在靠近PAM的地方存在一段种子(seed)序列，如果种子序列发生任何错配，就能导致靶点切割效率大跌甚至消失殆尽。基因组越庞大的生物越危险，尤其是拥有31.6亿个碱基的人类。脱靶效应导致的后果，可能是错误的表型，更麻烦的可能是假表型——删除了错误的基因，却与删除目标基因产生了相同的表型。所以sgRNA的设计优化仍是一项长期工作。
为什么CRISPR没有成为目前基因治疗的首选技术？，可以看看这篇文章

长长的路

脱靶的产生是因为gRNA识别错了的碱基序列。容易脱靶应该是设计的gRNA不好，打靶到了别的同源区。其实在gRNA设计阶段就可以很大一部分的脱靶可能性。再配以后期阳性克隆的高危位点测序脱靶分析，可以将CRISPR的脱靶效应控制的很好。

大力水手

博主你好！
Crispr/cas9的是目前应用最广泛的也是效率最高的第三代基因编辑技术。
优点是可以定向的查找并裁剪某段序列，删除该片段；缺点就是由于他是比较新的基因编辑技术，所以他的实验研究基础较弱，存在不稳定性。
当然他的缺点是一步步慢慢的被攻克的。
脱靶的问题，这里需要详细和你讲解的就是cas9蛋白若和目的基因病毒在一个载体上的话脱靶率是很高的。我们实验室目前均采用的是双载体，先由cas9蛋白的载体筛选完后，再上目的基因载体的病毒，这样的效果会更好一些。
希望可以帮助到你，谢谢。

大力水手

因为就算sgRNA和靶基因不是完全匹配，也有可能结合上去，招募cas9过去把靶基因切断，利用修复机制使该基因发生如移码等突变，最后使非靶基因沉默，产生脱靶。
另外，sgRNA是很短的，20-30nt，极有可能以完全配对的形式结合到与靶基因相似的其他基因上，产生脱靶。
题外话，由于脱靶效应未得到完美解决所以这项技术还只能停留在实验阶段，并不能进行医疗等人体实验，因为如产生脱靶，可能把一些生命活动相关的基因敲除，产生可怕的后果！

同花顺

crispr系统要实现精确打靶需要一个grna把cas9蛋白引导到特定的基因位置进行切割。
如果使用张峰老师的网站设计grna的话，一般就返还一个20nt长的grna，再加上一段ngg的pam序列，你可以理解为决定这次切割精确性的序列总长也就23nt。
在整个基因组中，其实很容易找到很多与你设计的这23nt序列就相差一两个碱基的序列，而这种序列往往就处在其他基因或者非编码序列里。这个你设计grna的时候一般会有一个可能脱靶位点的报告，基本上都是只差不到4个碱基的序列。这样的话，这些相似度很高序列就很可能也被你设计的grna切开。
当然，上述情况还只是默认四个核苷酸均匀分布在整个基因组上的情况。要知道，基因组里面有很多相似度非常高的基因，针对这些基因，操作难度就更大了。
针对这些可能脱靶的情况，也有一些对cas9的改进型，例如dual cas9(可能是这个名字，纯手打，记错了不负责任哈)，每条grna引导的cas9只能切开单链dna,需要两条grna一起到达指定位置完成切割才能完成基因组的断裂。这样理论上可以减少脱靶发生。