Western Blotting实验详细流程（一）

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原理：
基本原理其实很简单的，本质是抗原抗体的特异性反应；SDS-凝胶在电场作用下将蛋白按大小分开（处理使分离仅仅与蛋白分子大小相关），然后转移到固相载体上，比如常用的PVDF（一种特殊吸附蛋白材料-不改变蛋白或多肽生物活性），封闭PVDF膜上未结合的位点（降低非特异性结果的出现），经过孵育一抗（抗目的蛋白的anti-body）、二抗（酶标记-常用HRP），与HRP底物反应在显影仪检测下间接检测目的蛋白。大概就是这么一个过程，具体操作就是下面啦！个人觉得孵育抗体是一个关键环节，与结果有很大的关系，一定要注意抗体的配制和孵育条件呢！
图解：基本原理其实很简单的，本质是抗原抗体的特异性反应；SDS-凝胶在电场作用下将蛋白按大小分开（处理使分离仅仅与蛋白分子大小相关），然后转移到固相载体上，比如常用的PVDF（一种特殊吸附蛋白材料-不改变蛋白或多肽生物活性），封闭PVDF膜上未结合的位点（降低非特异性结果的出现），经过孵育一抗（抗目的蛋白的anti-body）、二抗（酶标记-常用HRP），与HRP底物反应在显影仪检测下间接检测目的蛋白。大概就是这么一个过程，具体操作就是下面啦！个人觉得孵育抗体是一个关键环节，与结果有很大的关系，一定要注意抗体的配制和孵育条件呢！
图解：






一、组织、细胞总蛋白抽提：参考相关裂解液；
二、蛋白浓度测定：BCA法，这个结果要参考说明书！
   准备：BCA试剂，BSA，PBS/生理盐水，96孔板，100ul、20ul、10ul移液*及*头，1.5ml及4ml EP管，冰河
1、配制BSA蛋白标准：配0.5mg/ml BSA，将25mg/ml的母液用RIPA 稀释成0.5mg/ml（RIPA可以换成PBS，下面的也是）；
2、将BCA试剂A与B按50:1（2450 A+49ul B）充分混匀，配置成适量BCA工作液(4℃)；
3、稀释BSA蛋白标准品和待测蛋白样品：用PBS稀释至20ul，再向每孔加入200ul BCA（ 在20-1000μg/ml浓度范 围内有较好的线性关系）


注：按RIPA-BSA-样本-BCA的顺序加入，操作要迅速！
4、锡纸遮盖，37℃恒温箱（或酶标仪）放置30min；
5、置于酶标仪上测定A562（或A570），用excel建立标准曲线然后计算出蛋白浓度；
注意：数据分析可以在Excel里做也可以在GraphPad Prism软件里做，R平方值越接近1数据越好
三、Western blot步骤：
（一）、玻板的清洗：
自来水→75%酒精擦拭→ddH2O→竖放晾干/吹干（做胶的一面朝内）【勿用手指触摸玻板内侧面】装板：
低的一面向内，确认玻板底部平齐，插入斜楔板压实卡紧，加ddH2O不漏，滤纸吸干水；
（二）、配胶（1.0mm）：      
分离胶


5% 浓缩胶， 3 ml/块胶：


注意：
①、用*吸取胶，沿玻璃板一侧注入，先快后慢，*头不要打到底以防产生气泡，胶面升到绿色板上缘，用75%酒精封闭液面；
②、室温放置约30min使胶充分凝固，待水和胶面之间有肉眼可见的折线，小心倒掉上层水，并用滤纸小心吸干水，勿碰触到胶面；
③、TEMED作用为促凝胶，如其他试剂放置时间较长或气温较低不易凝胶时，可适量多加1~2倍 TEMED，或者多加点AP，胶就会很快凝固的；
④、颠倒混匀后灌胶（约2ml），插入梳子，室温放置约30 min后，将玻板取出装入电泳装置，竖直向上将梳子拔出，放入电泳槽润湿板子，再拿出将玻璃板卡准；
补充下浓缩胶的作用：


（三）、点样及电泳：
1、用10 ul *吸取电泳液，倾斜45°反复吹打上样孔，去掉胶的残渣；
2、按顺序加样本，侧边孔加5ul marker，多余孔加入2ul loading buffer，迅速上样避免弥散；上样的量可以根据所测蛋白浓度来调整，有的建议20-40ug，有的50-100ug，其实个人觉得40-80ug比较适合的，主要看你样品浓度吧！
3、恒压80V 约20min；待样品进入二胶的分界线时（时间也不一定20min，跑到交界处就可以改变电压），120V 约90min（设I=200，T=2:00）(100mA的条件也跑过-六一产的）；
4、溴酚蓝跑至玻板底部，且Marker条带分的足够开时，停止电泳；
（四）、转膜：
准备（提前30min）：1×转膜液、培养皿、甲醇、PVDF膜、剪刀镊子、尺子、切胶板、托盘、转膜夹、冰袋及冰。
1、戴干净PE手套剪取PVDF膜（剪角做好记号以区分蛋白面），放入甲醇中浸泡约5min，用ddH2O平衡，再放入转膜液中15min；
2、轻轻撬开玻璃板，按Marker指示切下目的蛋白所在区域的凝胶，浸入转膜液中；
3、“三明治”：白板（+）→黑网→滤纸→PVDF膜→胶→滤纸→黑板（-）（记住蛋白带负电-向正极移动就行！）；
4、将夹子放入转膜槽中，冰浴恒流180mA 70min（其实200mA，90min比较好的）；
（五）、封闭：
提前配制封闭液（一直用的4% TBST配制的脱脂奶粉），将膜放入孵育盒中，于脱色摇床上60 rpm室温摇2h；
（六）、一抗孵育:
1、弃去封闭液，TBST洗1次×5min；
2、加入用TBST或5%BSA稀释的一抗（2%的TBST配制的脱脂奶粉，注意温度！特别是夏天，奶粉容易坏！），脱色摇床60 rpm 4℃ 过夜（或2-3h）；
3、回收一抗，TBST洗膜3次×10min，摇床80~100rpm；
(七）、二抗孵育：
加入用封闭液稀释的二抗，室温孵育60min；
TBST 洗5次×5min或3次×10min；
注意：洗膜时间可以稍微长一点，一抗和二抗的比例需要参考说明书，保存和回收条件也是，一抗是什么动物来源的，二抗就是抗一抗动物的抗体，比如说，一抗是来源于Rabbit，二抗就是Anti-Rabbit
（八）、ECL显色：
准备：显影液、玻璃片、保鲜、镊子、EP管、*及*头、滤纸。
在暗室中将ECL试剂以1：1混合（约100ul），用滤纸将PDVF膜稍干燥后置于玻板上，滴加适量显影液在蛋白面上， 显影；
选【印迹】-【Chemi】进行成像，actin设置10-30s、10张，目的蛋白设置20s-100s，20张，可延长至500-1000s；【其他】-【protein mark】进行marker成像；
注意：曝光的时间与蛋白大小有关系，一般小蛋白曝光时间短些，做多了就能找到合适曝光条件！
结果:





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