手把手教你做CRISPR实验（上）——基因敲除篇

二维码

装备清单

1、gRNA载体+Cas9载体
2、分子克隆实验平台（T4连接酶、T4PNK连接酶、特定的内切酶等）
3、细胞间+流式分选仪
4、一台能浏览网站的电脑
5、能看得懂一些英语的稳定廉价劳动力（研究生）
<hr/>教程概述

首先，我简单讲下原理。基因敲除的原理是利用gRNA复合体特异性识别一段序列，然后引导Cas9蛋白对其DNA双链进行切割（切割位点位于PAM序列附近），由于双链都被切割，宿主细胞失去了参考的模板，因此无法精准的修复，往往修复完后与原本的不一样。例如，在切割处丢失一些碱基或多出一些碱基。（当基因序列因切割后修复改变，gRNA复合体也没法识别已经更改的基因序列，因此Cas9便不会再对其进行切割，否则Cas9会不断地切割该部位）。 相较于基因敲除，基因敲入多了一个donor序列的设计步骤。donor序列的作用主要是等Cas9切割之后，通过同源重组（HDR）的方式将外源基因整合到这个切割位点上。
随着近些年基因编辑的技术不断开发优化，基因敲入和基因敲除的实验变得非常简单。基因敲除的实验流程大体只需要三个步骤，即（1）设计出能用的载体，然后（2）进行转染单克隆分选，最后（3）对分选出的单克隆鉴定。
设计gRNA序列（大概耗时30min）

获取基因组信息的方式：
通过Benchling获取（比较易于理解，但是缺少稀有物种的基因组，以及某些最新的基因组信息）
通过UCSC获取（相对易于理解，拥有稀有物种的基因组，例如Chinese hamster的基因组）
通过NCBI获取（较繁琐，拥有稀有物种的基因组，查询cDNA首选）
该教程主要使用Benchling进行理论教学，学会该教程之后一般都能触类旁通
1、打开https://benchling.com/ 注册，创建project




记得科学上网，用google账号登陆比较方便

2、点击CRISPR→ CRISPR guides



3、输入想要敲除的基因，选择尽可能新的数据库（虽然没什么差别）




GRCm39 是家鼠的最新基因组版本，而 GRCm38 是较旧的版本。新版本通常包含了更多的基因组信息，更好的精度，以及修复了以前版本中的错误和缺陷。Ensembl 数据库的每个发布版本都包括更新的注释、基因家族、蛋白质序列等内容。新的数据库版本通常包含了更多的数据，注释和修复了以前版本版本中的错误。

4、选择带有CCDS标识的转录本（选别的也没大问题）



5、复制敲除基因附近的一片序列




按Ctrl+C复制这段基因。我选择复制这么长的原因是因为根据经验，双gRNA一般切400bp以内的效果较好。所以选这么段

为什么选择Exon1的进行敲除？
首先是因为将起始密码子敲除后，基因往往不会表达。另外，Clec7a蛋白是从Exon1开始翻译的，如果你的敲除基因有可变剪接的话，需要考虑在实际翻译的Exon上进行敲除。
6、打开 http://crispor.tefor.net/ 左侧窗口粘贴复制的序列，右侧选择最新的转录本，以及对应的Cas9型号




我将上图复制的序列粘贴到Step1的方框里面。同时，因为我要敲除小鼠细胞系中的Clec7a，因此我选择最新版的小鼠Mus musculus的基因组。而我使用的Cas9是最为常见的SpCas9（识别的PAM位点是NGG），因此Step3选择这个。

7、从结果中选择合适的gRNA序列




根据gRNA的启动子，避免选到带有启动子终止密码的gRNA序列，例如U6启动子的gRNA不能带TTTT。简而言之，别选带三角感叹号的

Ex.1 什么是合适的gRNA序列？

（1）MIT 和CFD的特异性评分要足够高（70分以上）
（2）gRNA不要match到其他基因的Exon位点上
（3）关注网站提示的三角感叹号内容，不要选择带有U6启动子的终止密码子的
（4）使用单gRNA敲除，要选择切割到外显子的gRNA。而使用双gRNA敲除，要选择切割片段包括外显子的
什么是单gRNA敲除？——即移码突变
只用一条gRNA引导Cas9进行切割。当单gRNA引导Cas9切 割之后，能够造成gRNA结合部位处DNA双链断裂。断裂后 DNA尝试重新连接修复，修复过程中会造成插入或缺失碱基。 如果插入非3倍数个碱基（1个）的话，后面的密码子会错位， 导致整个基因错位。
什么是双gRNA敲除？——即片段敲除
用两条gRNA引导Cas9进行切割，使得外显子丢失一块功能片段，或丢失含有启动密码子的一部分片段。
Ex.2 单gRNA敲除 VS 双gRNA敲除

单gRNA敲除通常相对简单，只需要设计和使用一条gRNA，降低了实验复杂性。但单gRNA敲除可能无法完全消除目标基因，因为在目标基因的非靶向部分仍可能产生部分蛋白质。此外，在采用移码突变进行敲除的过程中，基因可变剪切的关键位点可能发生突变而产生新的转录本，蛋白翻译时可能跳过突变的起始密码子以其他AUG为起始密码子重新启功翻译等。另外，如果选择的敲除位点相对靠后，而抗体与蛋白的结合区域若存在于敲除位点之前，便可能会出现抗体与N端残留蛋白的结合，从而导致Western Blot检测条带，出现假阳性结果。
双gRNA敲除涉及两条gRNA，通常能够更有效地实现基因的彻底敲除，因为它删除了两个gRNA之间的基因片段。这可以减少残留的蛋白质风险，降低假阳性结果的风险。然而，双gRNA敲除相对更复杂，需要更多的实验设计和操作，包括设计和验证两条gRNA。此外，敲除片段的长度可能需要根据基因的特性来调整，太长或太短的片段可能影响效率。因此，选择单gRNA还是双gRNA敲除策略应该根据具体的实验需求和目标基因的特点来决定。
总之，如果有多个外显子，建议用双gRNA切掉第一个外显子，直接让基因不启动表达。如果只有一个主体的外显子，也建议用双gRNA切了。另外，如果能先确定抗体，可以找抗原识别位点，把这段切掉，以免WB验证不好看。此外，抗原识别位点必然意味着这段基因参与蛋白的合成，不会因为转录后修饰而丢失。当然，选择敲除位点前，有必要阅读先前文章，对蛋白各个区域的功能进行分析。以此选择合适的敲除位点
例如：Clec7a的抗原识别位点是：SWDGSKRQCWQLGSNLLKIDSSNELGFIVKQVSSQPDNSFWIGLSRPQTEVPWLWEDGSTFSSNLFQIRTTATQENPSPNCVWIHVSVIYDQLCSVPSYSI






由图可看出抗原识别位点一部分在Exon4，另外一部分在Exon5和6。因此，在选择敲除位点时候，可以考虑敲除该部分基因。
8、二次验证gRNA的特异性：打开http://genome.ucsc.edu/ 的Tools→Blat



9、依次输入你选择的gRNA序列

本次我选择的2条gRNA为：





前面20个bp为gRNA，后面的TGG为PAM序列

只需要选择前面20个碱基进行blat


结果发现blat定位无误
构建gRNA质粒（此教程以pc126-Bbs1质粒为例，大概耗时12h）

到这个步骤，恭喜你！你已经拥有了gRNA的序列，那么你只要将这个序列插入质粒就行啦！
接下来的教程只演示制作其中的一个gRNA。



这个是pC126的图谱



这个是该质粒的gRNA插入位置

1、订购gRNA的序列




简要解释：黑色部分是我刚刚设计的20个bp的gRNA，蓝色部分是跟它互补的片段。设计蓝色的目的是为了形成互补的双链，以此与下图酶切之后的质粒相互补。红色部分（CACC, CAAA）是为了与载体质粒的粘性末端互补连接（GTGG, GTTT）。绿色部分：如果gRNA的第一个碱基（T）不是G，则必须额外增加个G

序列需要注意方向，所以Oligo2需要倒过来填表，即5‘AAACGATTCTCTATATGAGAGTGAC3’
2、将两个订购的oligo做成互补的双链

根据下面的反应体系加样品加到PCR管中，震荡混匀


3、制备线性化质粒




这一步需要根据你质粒和酶的特性进行选择

下面介绍一下所谓的golden gate原理（该原理涉及更进一步的CRISPR screening文库的制作）



可以看出，Bbs1识别的是GAAGAC，只要你的gRNA没有这个序列，那么就不用担心Bbs1会切割你的gRNA克隆。在设计大量gRNA时候，可以关注序列下方的Enzyme表。

4、连接gRNA序列与线性化载体



5、将构建好的质粒转入感受态细菌

（1) 将感受态细胞从-80°C冰箱拿出，放到冰上融化（5min左右）。
（2）将待10μl转化DNA加入到50μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。
（3）42°C水浴热激45sec后，迅速置于冰上静置2min。
（4）向离心管中加入900LB液体培养基（不含抗生素），混匀后置于37°C，200rpm摇床中复苏1h。
（5）2,500g离心3min，弃900μl上清，用剩余培养基将菌体重悬后，均匀涂布在含相应抗生素的固体培养基上。
（6）将平板正置于37°C培养箱10 min，待菌液被完全吸收后，倒置平板，过夜培养。


6、挑单克隆（一般挑5个即可，用1ml EP管摇菌扩增），进行sanger测序





以pc126为例，使用hU6-F（GAGGGCCTATTCCCATGATT）或者LKO.1 5&#39;作为Sanger测序引物，进行测序。
看测序结果，判断gRNA是否连接上载体
7、通过Sanger测序，找到合适的质粒

要求：找到既正确插入了gRNA的oligo片段，也没有任何其他质粒元件的缺失损坏



这个是gRNA：TCGGCCAAGACAGGTCGCTC的结果。通过Sanger测序和质粒图谱的比对，可以看到gRNA已经插入质粒中

8、利用T7核酸内切酶观察设计的gRNA质量（可选）

9、对转入正确质粒的单克隆菌液进行摇菌扩增（200ml），随后进行质粒抽提

大提要点：注意购买去内毒素的抽提试剂盒（一般买中提或者大提的）；千万不能用TE buffer溶解质粒，记住要用ddH2O。
进入细胞实验阶段（大概耗时2周）

1、利用转染试剂或电转，进行细胞转染

经验之谈：转染效果往往跟转染试剂的价格成正比：，即非脂质体＜Opti-MEM电转＜脂质体＜用特制电转液电转。该经验来源于免疫细胞系，以及iPSC的电转效果。HEK293的话，说实话用什么试剂都能转。
2、单克隆分选

前期工作：准备好96孔板，在96孔板的四周加上300ul的DPBS（含双抗），中间6X10的孔中，加入300ul完全培养基（含双抗）。最后用无菌的parafilm封好四周。
（1）将转染结束的细胞消化下来
（2）500xg离心3min，用DPBS重悬
（3）细胞悬液过300目细胞筛，筛出单细胞悬液
（4）加入DPBS和培养基的96孔板，以及单细胞悬液一同置于冰上，等待流式分选
（5）上机分选，准备好的60个孔，每个孔分选入1个细胞
（6）分选后仍然将96孔板放在冰上保存
（7）将细胞放回培养箱中培养，5天后换液
（8）等待细胞分裂增殖到超过50%汇合度（一般会需要2周时间）
（9）消化细胞，随后利用孔板离心机离心细胞，弃消化液
（10）加入300 μl完全培养基到每个孔中，平均传到两块96孔板中（150 μl每孔），一块用于传代，一块用于PCR鉴定
（11）通过设计引物，进行PCR，检测基因是否敲除
（12）为进一步验证，将PCR产物送去Sanger测序
3、将敲除正确的多个单克隆进行扩增并冻存

你需要多留几个不同的单克隆，以免某些单克隆的细胞特征与WT细胞差异过大。（一般文章中会使用3个不同的单克隆）
<hr/>到此，你已经完成了整套CRISPR-KO的实验流程。

接下来就是基因敲入的内容啦！


原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/666405435