PCR技术基本原理

HaHa

DNA的半保留复制

DNA复制时，以亲代DNA的两条链分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下，按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，组成新的DNA分子，新形成的两个子代DNA与亲代DNA的碱基顺序完全一样​。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，而另一条链是新合成的，因此这种复制方式称为半保留复制(semi-conservative replication)。
DNA的复制过程




DNA复制过程

DNA复制酶系作用顺序

1. 拓扑异构酶
使DNA超螺旋结构解开，形成其基本的双螺旋结构。
2. 解链酶
使DNA双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA，构成”复制叉“。
3. 单链DNA结合蛋白
单链DNA结合蛋白结合在两条单链DNA上，稳定单链DNA，阻止DNA复性，避免被核酸酶降解，便于复制子代DNA 。
4. 引物酶
是一种依赖DNA的RNA聚合酶，该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物，以提供自由的3'-OH，形成引发体，使子代DNA链能够开始聚合。
5. DNA聚合酶
由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为3'→5'。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。
以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子链，在复制时连续合成，子链的聚合方向为5'→3'，这一条新合成的子链被称为前导链(leading strand)。以5'→3'方向的亲代DNA链为模板，合成子链的过程不连续，这条链被称为随从链(lagging strand)或滞后链。
DNA双链在复制时逐步解开，因此随从链的合成是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段 (Okazaki fragment)。
6. DNA连接酶
在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。
<hr/>PCR (Polymerase Chain Reaction)

聚合酶链反应简称PCR，是以DNA半保留复制机制为基础，发展出的体外酶促合成、扩增特定核酸片段的一种方法。
DNA体外复制的所需条件

模板和底物

DNA复制是模板依赖性的，必须以亲代DNA链作为模板，亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。同时，DNA复制需要以四种脱氧核糖核苷酸，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，为底物合成子代DNA。
在体外进行DNA复制时，模板和底物均可通过人工添加解决。
引物

DNA聚合酶必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物，才能开始合成子代DNA链。
在体外进行DNA复制时，可以人工合成具有特定序列的寡核苷酸作为引物，该引物序列与进行扩增的目的核酸片段互补匹配，从而开始目的片段的扩增。
因为引物的碱基序列需要与目的片段相匹配，在合成引物之前，必须首先已知目的片段的碱基序列，至少也要知道目的片段的部分序列，从而确定合成引物的碱基序列。
模板双链的解旋

在DNA的半保留复制机制中，双链DNA的解旋是在拓扑异构酶和解链酶的作用下完成的，该过程需要拓扑异构酶识别DNA的复制起点才能开启，而体外扩增特定的核酸片段只需要特异性的复制目的核酸片段，因而需要一种方式使得模板DNA解旋为单链DNA，之后在使之与引物结合，从而特异性的扩增目的核酸片段。
DNA的变性

DNA变性是指核酸双螺旋结构中碱基对的氢键断裂，使得双链变为单链的过程。
对双链DNA进行加热可以使其发生变性，当温度升高到一定高度时，DNA在260nm处的吸光度会突然发生明显的上升，并达到最大值，之后温度继续上升，其吸光度也不会发生明显变化，若以温度对DNA溶液的260nm吸光度做图，会得到典型的DNA变性S型曲线。
DNA的变性是在一个很窄的温度范围内发生的，通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值50%时的温度称为核酸的熔解温度 (Tm, melting temperature)。

• 特定核酸分子的Tm值与其G+C含量成正相关，GC% = (Tm-69.3) × 2.44；
  
• Tm值的大小还与核酸分子的长度有关，核酸分子越长，Tm值越大；
  
• 粒子强度越高，熔解温度越高，熔解温度范围越窄。
  

DNA的复性

加热变性的DNA在缓慢冷却后可以由单链恢复为双链结构，这一过程称为DNA的复性，也称为“退火 (annealing)”。
当温度降低至比变性DNA的Tm低25℃时，其复性效果最佳，越远离此温度，复性效果越差。
因此，可以利用此特性，在加热使模板DNA变性后，将温度降低至特定温度，从而使所加引物与模板DNA复性结合，进而能够对引物所规定的核酸片段进行特异性的扩增。
DNA聚合酶

为了使模板中特定的核酸片段进行扩增，在模板与引物结合后，需要有DNA聚合酶的参与，但是由于DNA变性和复性过程的温度较高，普通的DNA聚合酶在此过程中会由于温度过高而失活。
科学家为了解决该问题，从水生栖热菌 (Thermus Aquaticus) 中分离出了具有热稳定性的DNA聚合酶，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活。
PCR技术的原理

在存在DNA模板、引物、dNTPs、适当缓冲液  (Mg2+)  的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的核酸片段进行扩增，这种扩增是以模板DNA与引物之间的变性、退火、延伸三步反应为一个周期，循环进行，使目标DNA片段得以扩增。
PCR反应体系

反应体系为100μL的PCR反应，其反应混合物为：

• 模板DNA 0.1～2μg；
  
• 前后引物各20pmol；
  
• 20mmol/L Tris-HCl缓冲液 (pH 8.3)；
  
• 1.5mmol/L 氯化镁；
  
• 0.05% Tween 20；
  
• 100mg/L灭菌的明胶或无核酸酶的牛血清蛋白；
  
• 1000μmol/L的四种dNTP；
  
• 25mmol/L KCl；
  
• 2U的Taq DNA酶。
  

PCR反应条件

1. 预变性：
95℃，5～10min；
进行PCR反应的第一步是要对反应体系进行预变性，该过程的目的是使模板DNA分子完全变性同时激活热稳定的DNA聚合酶，具体时间建议参考所用DNA聚合酶的使用说明书。
2. 按如下过程，进行30次循环“变性-退火-延伸”的PCR反应：
2.1 变性：
95℃，10～30s；
正常的PCR循环过程中，变性的时间不需要太长，30s以内即可完成目的DNA片段的变性，在可能的情况下可缩短该过程的时间，因为变性的时间过长会损害DNA聚合酶的活性。
2.2 引物退火：
引物特定退火温度，30s；
退火的温度由引物和产物的Tm值决定，如果退火温度选择不合适，会导致非特异性的扩增。
最适合的退火温度T = 0.3 × Tm(引物) + 0.7 × Tm(产物) - 25；
Tm(产物) = 8.15 + 16.6lg[k+] + 0.41 × GC% - 675/L，L为PCR产物的长度。
2.3 引物延伸：
72℃，1min。
引物与模板结合后的延伸过程一般在72℃进行，该温度下DNA聚合酶的活性最高，该过程的时间由目的扩增片段的长度决定，一般时间为1min/kb，即目的片段的长度为1000bp时，延伸时间设为1min。
3. PCR反应的最后延伸和终止；
在最后一次反应循环结束后，应使PCR反应在72℃进一步延伸5～10min，使得未完全延伸的扩增片段全部延伸完全，以提高产物的扩增效率；
然后，将反应混合物冷却到4℃，或加入10mmol/L的EDTA终止反应。
<hr/>逆转录PCR

PCR反应需要以双链DNA作为模板，因此最初的PCR反应用于检测目标样本的基因组中是否存在特定的目的片段，但是这种以基因组DNA为模板的PCR反应无法检测目的基因是否在样本中表达，此外由于真核生物的基因中存在内含子，直接通过基因组DNA进行PCR也很难确定样本中是否存在目的基因，针对这一问题，发展出了逆转录PCR的技术。
技术原理

逆转录PCR (reverse transcription PCR，RT-PCR) 是以mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA，之后再进行PCR的过程。
mRNA逆转录合成cDNA的过程分为两步：

• 在特定引物的介导下，通过逆转录酶的催化下以mRNA为模版合成互补的cDNA第一链；
  
• 升高温度使cDNA第一链与mRNA解离，然后降温，使其与另一引物退火结合，并由DNA聚合酶催化延伸生成cDNA第二链。
  

RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品的分析成为可能，该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
逆转录反应体系

1. RNA模板
通常20μL的逆转录体系，加入总RNA 1μg，如果总RNA加入过多，会导致逆转录不充分。
2. 引物
常用的有随机引物和Oligo(dT)引物：
随机引物会将所有RNA分子均进行逆转录，此时得到的cDNA大部分来源于rRNA，主要在部分mRNA含有逆转录酶终止序列而难以得到其全序列时使用；
Oligo(dT)与真核生物mRNA的Poly(A)区域匹配，可以特异性的对mRNA进行逆转录。
3. 逆转录酶
逆转录过程涉及以RNA为模板合成DNA和以DNA为模板合成互补链的两个过程，目前市场上的逆转录酶都同时具有这些功能，因此只需在反应体系中加入逆转录酶即可，而不需额外加入DNA聚合酶。
4. 4种dNTPs
<hr/>其它PCR技术

• RL-PCR：检测蛋白质和RNA在体内的相互作用；
  
• RNA-PCR：检测痕量RNA和低表达的基因；
  
• 反向PCR：扩增已知序列两侧的DNA；
  
• RACE：获得mRNA完整序列；
  
• LM-PCR：在模板的一端加上公共接头，这样只需知道一端的DNA序列就可以对任何DNA片段进行扩增；
  
• 重叠延伸PCR：对目的基因进行定量突变。
  

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