知识分享-CRISPR-Cas9基因编辑原理

病理医师

今天来分享CRISPR-Cas9系统相关知识，如有不对的地方，欢迎大家指出～
1、CRISPR-Cas9系统形成过程



图1 CRISPR-Cas9形成及作用过程

当外源DNA入侵时①（在此次入侵前就曾偷袭过，即不是第一次交战），细菌会做出以下反应（②-⑤）：
② 转录出tracrRNA（trans-activating crRNA，反式激活crRNA）；crRNA：CRISPR RNA;
③ Cas9蛋白被转录翻译，同时Cas1、Cas2、Csn2 会附着在Cas9蛋白上；
④ CRISPR序列在前导区的调控下转录产生pre-crRNA（Pre-crRNA，crRNA的前体）；
⑤pre-crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链RNA，与Cas9蛋白组装成一个复合体，根据入侵者的类型，选取对应的间隔序列RNA（图示中的1号间隔序列），利用RNaseⅢ编辑成为成熟的crRNA（包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区）。
成熟的crRNA形成后，与Cas9蛋白、tracrRNA（稳定复合体结构）形成RNP复合体复合体（CRISPR-Cas9系统形成），对外源DNA进行切割，这样就做到了在敌人进一步动作前歼灭。
注：我们平常构建的sgRNA=tracrRNA（sccafold）+ crRNA
（以下讲述主要是根据B站up主PRIMARYFOREST的视频进行的图片以及文字可视化）
2、新外源基因的捕获
面对认识的敌人，可以直接进行①-⑤的防御过程，如果是新的入侵序列，细菌就要经历以下图中的生物学过程，即首先将新的外源序列整合到CRISPR系统，然后再重复①-⑤的防御过程。



图2 新入侵序列的整合过程

具体流程如下：将PAM上游20个碱基作为原间隔序列，对其进行完整切割，并整合到原CRISPR序列上，生成一个新的间隔序列，这样就可以对新的入侵核酸序列进行切割，进而消灭啦~
注：PAM—Protospacer adjacent motif，原间隔序列 ，具体表现为NGG，N代表A、T、C、G四种碱基；图3中除了识别紫色框中的序列，还可以识别出GAGGAGAGGGAACGCAGGG序列。
3、CRISPR-Cas9剪切方式及应用
Cas9蛋白包含两个切割结构域：HNH结构域、RuvC结构域，具体切割位置是PAM上游三个碱基的5’端（图2中红色箭头所示位置）
HNH结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，RuvC结构域负责切割另外一条非互补DNA链（如图3中白色尖角所示）。



图3 CRISPR-Cas9编辑系统

我们可通过调节两个功能结构域进行基因编辑：
基因敲除（knock out）
当两个结构域均发挥功能时，Cas9蛋白可切割DNA两条链，通过DNA修复过程中差错修复引入碱基变异；
基因敲入（knock in）
如果HNH结构域与RuvC结构域中，一个结构域失活，Cas9蛋白只切割DNA一条链，造成DNA缺口，称为nCas9(Cas9 nickase)，可以保证CRISPR-Cas9介导的基因敲入效率更高以及引入更少的突变；
基因干扰（interference）
如果HNH结构域与RuvC结构域均失活，则形成dCas9(dead Cas9)，这使得CRISPR-Cas9系统只有结合目的DNA的功能，不能行使切割功能，在dCas9后加入转录调控因子后，可以转录激活或抑制下游基因的表达，由此产生了CRISPRa(CRISPR activation)与CRISPRi(CRISPR interference，CRISPR干扰)

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