ELISA的五种实验原理及常见问题分析

幸福侠侣

一，简介
酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。
二，实验原理
主要有 5 种方法：双抗夹心法、竞争法、直接法、间接法、捕获法
（1）双抗夹心法：适用于大分子物质的检测。将已知的可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体表面，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法,具有快速、灵敏、简便等优点。


（2）竞争法：竞争法适用于较少表位的小分子物质。将抗体包被于微孔板中，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，加入标准品和生物素标记的抗原物质进行竞争结合。


（3）直接法：主要用于抗原的检测，将抗原直接固定在固相载体上，洗涤后加入酶标特异性抗体，洗涤后加入底物显色，该方法对抗体的特异性要求较高。



（4）间接法：主要用于抗体的检测。将特异性抗原包被在固相载体表面，与标本中相应特异性抗体结合，洗涤后加入酶标的抗体，洗涤后加入底物显色。该方法对抗原的特异性要求较高。


（5）捕获法：捕获法主要用于血清中某种抗体亚型的检测。先将针对 IgM的第二抗体连接与固相载体，用以结合样品中的所有 IgM，洗涤除去 IgG等无关的物质，然后加入特异性抗原与待检 IgM结合，再加入抗原特异的酶标抗体，最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶标抗体复合物，加酶底物显色即可对样品中待检 IgM是否存在及其含量进行测定。



三，实验步骤（以双抗夹心法为例）
（1）准备好需要的标准品和试剂
（2）向孔中加入100ul标准品或待测样本
37℃孵育2小时, 然后洗板3次
（3）每孔加100ul生物素化抗体工作液
37℃孵育1小时, 然后洗板3次
（4）每孔加100ul链霉亲和素-HRP工作液
37℃孵育0.5小时, 然后洗板3次
（5）加入100ul 底物溶液，37℃避光，孵育15-20分钟
（6）加入50ul终止液
（7）5min内检测450nm波长的OD值
校正波长设置为570nm或630nm
（8）导出数据并进行分析。
四，实验问题及解决方案



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