5年经验总结：荧光定量 PCR实操技术

大v

回想我刚进入实验室的时候就接触到了荧光定量PCR，作为一个刚毕业的小白，面对一堆名词，哑巴吃黄连，有苦说不出，一头雾水。扩增曲线、标准曲线、域值、CT值、熔解曲线、基线到底都是什么意思？那些荧光图色彩斑斓的很漂亮但是我好像不认识它？
吾日三省吾身，定量实验做对照了吗？今天就带大家一起学习一下基本概念、实验步骤等实时荧光定量PCR必须掌握的点！
<hr/>RT-QPCR 基本原理和概念

实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过在PCR反应体系中加入荧光染料(SYBR Green)或荧光标记的特异性的探针，与DNA产物特异性结合，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，最终通过相对定量或荧光定量的方法确定各个样本的本底表达量。可以用于检测mRNA、lncRNA、miRNA、circRNA的基因表达水平。


<hr/>检测方法

• TaqMan 荧光探针：
  PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的 5&#39;-3’ 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。
  
• SYBR 荧光染料：
  在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。
  

<hr/>RT-QPCR操作流程




1）样本处理

• 植物组织：以叶片 RNA 提取为例。取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在 TRNzol 试剂中研磨，研磨要迅速，最好不要超过 1 min 。大约 100 mg 叶片使用 1 ml TRNzol 试剂。
  
• 动物组织：以鼠肝脏 RNA 提取为例。取新鲜或-70℃冻存组织，每 100 mg 组织加入 1 ml TRNzol  试剂， 用高通量组织研磨器快速充分匀浆 (2500rpm 2min，肌肉、肠、子宫等组织研磨前须剪碎，2500rpm 3min),  匀浆后观察直至无明显组织块。样品体积一般不要超过 TRNzol 试剂总体积的 10%。
  
• 单层培养细胞：单层贴壁细胞的收集 (收集细胞数量请不要超过 1×10⁷ ) ：可直接在培养容器中裂解 (容器体积不超过 10 cm³) ,  或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。(在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法) 。
  
• 细胞和细菌悬液：离心取细胞。每 5×10⁶ - 1 × 10⁷  细胞加入1 ml TRNzol  试剂。加入 TRNzol试剂前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。细菌在处理前需要加入溶菌酶进行裂解。
  
• 血液与病毒液处理：直接取新鲜的血液或病毒液，加入3倍体积TRNzol 试剂(推荐 0.2 ml 全血或病毒液加入0.6 ml TRNzol试剂) ，充分振荡混匀。
  

2）总RNA提取

• 将处理好的样本室温反应 10 min ，使 TRNzol 充分发挥裂解作用。
  
• 加入 200ul 氯仿，剧烈摇荡 15 s ，不要使用振荡仪。室温放置 10min ，使溶液充分混合均匀。
  
• 4℃ 12000rpm  离心 15min 。离心后溶液分为三层， 由下至上为：酚仿层、中间白色蛋白层和澄清的水层，RNA  存在于水层中。
  
• 取上层水相 400 µL  于新的离心管中，等体积加入异丙醇 (4℃预冷) ，-20℃放置 15 min。
  
• 4  ℃ 12000rpm  离心 10 min 。RNA  沉淀后呈胶状片层。
  
• 弃上清，加入 1 mL 75%乙醇 (4℃预冷) 洗涤 RNA 沉淀。
  
• 轻轻上下翻转，充分洗涤。4  ℃ 12000 rpm  离心 5 min。
  
• 小心弃上清，用移液器将残留液体吸干净。在超净工作台上吹干，时间 3-5 min。
  
• 将 RNA  溶于 50 µL DEPC  水中。静置 5 min ，  用枪吹打使其充分溶解。
  
• RNA  的纯度与浓度检测：NanoDrop 测定提取 RNA  的 OD  值和浓度，根据 260 nm/280 nm  吸光度比值确定 RNA  的纯度，吸光值在 1.8~2.0  时说明 RNA 质量较好。
  
• RNA  的完整性检测：用 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA  的完整性，通常真核生物的 28S RNA 与 18S RNA 条带亮度比为 2:1。
  
• RNA  样品长期保存于-80  ℃冰箱。
  

<hr/>RNA 中基因组 DNA 去除

• 将以下成分加入到一个 RNase/DNase-free 管子中：
  

试剂	_	用量
RNA	_	5µg
10×DNase I Reaction Buffer	_	2 µL
DNase I	_	0.5 µL
RNase/DNase-free ddH₂O	_	Up to 20 µL

• 37 ℃孵育 30min ，加入 1 µL 200 mM EDTA 作为反应终止液。
  
• 65 ℃  孵育 10 min ，失活 DNase I。
  
• 用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 去除情况。
  

<hr/>*紫外分光光度法测定RNA浓度和纯度
在pH8.0的TE缓冲液（在酸性缓冲液中，Abs 260nm：280nm比值会偏低）稀释RNA，并在260nm和280nm下测量吸光度。
RNA 浓度= 40ug/mL×稀释倍数×Abs 260nm
一般Abs 260nm：280nm比率应该是1.7-2.1，说明RNA的纯度较好。RNA产量会根据材料的类型和数量以及储存条件的不同而变化。
*RNA条带完整度测定
为了评估RNA的完整性，取部分样本做琼脂糖凝胶电泳。完整的RNA条带包括28S，18S和5S核糖体RNA。通常，28S / 18S> 2意味着RNA具有较高的完整度。）
<hr/>3）RNA 的体外反转录
反应混合物，总体系：

试剂	用量
RNA	11 µL
反转录引物	1 µL
5 × Reaction Buffer	4 µL
Ribolock RNA 酶抑制剂 (20U/ µL)	1 µL
Revertaid M-MuLV 逆转录酶 (200U/µL)	1 µL
10 mM dNTP Mix	2 µL
RNase/DNase-free ddH₂O	Up to 20 µL

备注：

• 如果 RNA 模板 GC 含量高或者含有二级结构，将模板和引物的混合液轻轻混匀，短暂离心，65 ℃孵育 5min ，冰上冷却，离心，再置于冰上。
  
• 如果使用 Oligo  (dT) 18 或者基因特异性引物，42 ℃孵育 60 min；如果使用随机六聚体引物，25 ℃孵育5 min ，随后 42 ℃孵育 60 min。
  
• 反应产物可直接用于 RT-PCR 反应或者在-20℃保存少于一周的时间。长时间保存，放入-80℃冰箱。
  

*引物设计
在Primer5.0软件上设计特异引物。
引物设计标准：

• PCR扩增子长度：50-180bp
  
• 引物长度：17-25bp
  
• GC含量：45-55％
  
• Tm：58〜68℃，引物对间差异不大于2℃
  
• 碱基要随机分布，尽量均匀。3′端要避开AT，GC rich的区域，避开T/C或A/G连续结构（2-3个）。引物自身和引物间不能存在互补。引物3’末端为G或C
  
• 避免DNA污染，跨外显子接头区
  
• 至少设计2-3对引物，预实验筛选最佳引物
  
• 将所有设计的引物在NCBI数据库中比对以确定它们对靶基因特异性
  

<hr/>4）RT-PCR 程序
反应体系：（左边试剂，右边用量）

cDNA	100ng/ 1 µL
引物 F( 10µM)	0.4 µL
引物 R( 10µM)	0.4 µL
SYBR mix	10 µL
ROX Reference Dye  (50×)	0.4 µL
RNase/DNase-free ddH2O	Up to 20 µL

备注：
一般使用cDNA模板的10倍稀释液，即100ng/ul加入反应体系，因为过高浓度的反转录体系残留如逆转录酶和相关缓冲液组分会抑制DNA聚合酶活性，从而降低扩增效率。

*Real-Time PCR 程序



5）数据分析

• Ct 值：C 代表 Cycle，t 代表 threshold，Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，因此只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
  
• 相对定量：检测实验组和对照组中一个靶基因的倍数差异。如果对RNA模板的数量不能精确定量，或者只需要知道目的基因的表达差异时，可以使用相对定量法。
  
• 绝对定量：是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。检测给定数量的样品中靶基因mRNA拷贝数。如果想知道每毫升样品中的某基因的拷贝数时，使用绝对定量。
  
• 扩增曲线：早期循环中，荧光信号几乎没有变化。随着反应的进行，每个循环的荧光水平开始显著上升，被称为指数期。一般在在指数期的早期阶段而不是后期的平台期进行定量分析。在指数阶段开始时，所有的试剂仍然是过量的，DNA聚合酶仍然高效，并且扩增产物量还较低，不会在退火时与引物竞争。这些因素都有助于更准确的定量。
  

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