FISH技术

虎威将军

一、实验流程
FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。

二、实验步骤（甲酰胺法）
▲  玻片准备：
将已收获的标本滴在玻片上，在显微 镜下观察滴片质量并标记杂交区域。
理想的标本 质量为：细胞分布均匀不重叠，密度适中，胞浆 含量少。将玻
片放入已37℃水浴预温的 2×SSC 溶液中，老化30 min。70％ 、85％ 、
100％ 的乙 醇中室温下梯度脱水各2到3分钟，室温下晾干。
玻片DNA变性：
将玻片放入已在73±1℃  水浴中预热的70%甲酰胺/2×SSC混合液  中，每
缸≤4张玻片变性3～5min，取出分  别在70%、80%、100%冰乙醇缸中脱
水各2分  钟而使变性终止。玻片室温下晾干。   
▲ 探针变性：
①探针准备（按产品说明书配制不同探针）
例：LSI BCR/ABL双标双融合易位探针准备如下：
a. 杂交液（buffer）   7μl
b. H2O                      2μl
c. 探针                       1μl
d. 加入到0.5ml离心管中混匀，离心1～3秒。
②将装有探针的离心管放入73±1℃水浴箱中，变 性处理5分钟，移至37℃
水浴箱中预杂交5min。
▲ 杂交：将10μl探针加在玻片上已划定的杂  交区域内，用22×22mm盖玻片
盖好，注意  避免气泡的出现，再用封片胶封好四周，  略干后放入保湿盒
内，在37℃恒温箱中杂  交16～18h。   
▲洗涤：
①将3缸50%甲酰胺/2×SSC溶液中，2缸 2×SSC置46±1℃水浴箱中预温
30 min。
②将杂交后的玻片去除盖玻片依次放入已 46±1℃预温的1、2、3号50%甲酰胺/2×SSC 溶液缸中，每缸≤4张玻片，洗涤各10 min。
③将玻片转至已46±1℃预温的2×SSC溶液 中，洗涤各5 min。
▲ 复染：每个杂交区域加DAPIⅡ10μl，盖玻 片封片，室温中复染15分
钟。  
▲ 镜检：每张片随机分析计数200～1000个间 期核，并记录杂交信号。
▲杂交仪法
玻片准备：同甲酰胺程序的玻片处理
探针准备：同甲酰胺程序
杂交：   
①将10μl探针混合液加在玻片上划定的杂交区域 内，用22×22mm盖玻片
盖好，封片胶封片，将 玻片放入杂交仪或恒温热平台上  
②杂交仪设置：变性温度72-75℃，时间2～5min， 杂交温度37℃，时间
16～18h
洗涤：同甲酰胺程序
复染：同甲酰胺程序
镜检：同甲酰胺程序
▲快速BM涂片
1）标本处理：骨髓涂片放入3:1 甲醇冰醋酸固定液中5-10 分钟；2×SSC溶液两缸各浸泡5分钟  • 70％ 、85％ 、100％ 的乙醇中室温下梯度 脱水各2到3分钟，室温下晾干 暗视野下选取杂交区域，其余步骤同杂交仪法。



2）石蜡切片FISH
组织切片的制备、脱蜡和水化 ①制备 切片机切下厚度为4-5um组织，37℃水浴展 片，贴于玻片上，晾干，56 ℃烤过夜。 ②脱 蜡  用钻石笔标出杂交区域，将切片浸入二甲 苯中,10分钟×2次，室温用100％的无水乙醇脱水， 5分钟×2次 ③水化 将玻片依次浸入室温100%、85%、70% 乙醇各2分钟水化。
3）增强组织通透性处理
①将蒸馏水和2ml EDTA加入压力锅烧沸
②将玻片置入沸水中，加热至喷汽
③转入蒸馏水中2分钟  
4）蛋白酶处理
①将蛋白酶预温至37 ℃，切片浸入20分钟
②转入蒸馏水中1分钟，再依次脱水
③室温风干  
5）FISH杂交、洗涤、观察同“杂交仪法”  
膀胱癌脱落细胞FISH
收集晨尿，离心，收集细胞沉淀。
低渗、预固定和固定同“染色体制备”。
FISH操作步骤同“杂交仪法”。
镜检注意：选择DAPI下染色不均一、核大、椭 圆的脱落细胞观察，排除
炎症细胞。

三、注意事项
FISH对检测的条件要求很高。检测过程中的温度、试剂的酸碱度，反应的时间都会对结果产生影响。因此在操作中应注意：
1）杂交前样本的老化相当重要，尤其是胃蛋白酶的浓度、消化的时间掌握不好，直接影响杂交的效果。若消化过度，细胞出现“鬼影”或整个组织消失成为废片；若消化不足，则显示持续的自发荧光或者差的DAPI染色；
2）操作过程中的温度控制应严格按照产品说明书，而且在反应前把液体预温到所要求的温度，检测中所使用的设备例如盖玻片、载玻片都应注意预热；
3）各步骤时间应准确，每次操作都要迅速；
4）为防止淬灭，杂交后的洗脱和晾干要注意避光。可以加入抗淬灭剂；
5） 此种片在-20℃避光保存1周。若要长期保存，应加入抗淬灭剂；

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