ELISA实验指南！！新手必读

John

为了帮助初学者快速上手，减少实验摸索的苦恼，我们专门整理了这篇干货，为大家详细介绍ELISA实验方案设计、初始数据判读及实验结果计算，一起来看看吧！

ELISA实验方案设计
一个周密而完善的实验方案设计，需要合理地安排各种实验因素，严格控制实验误差，从而避免盲目开展实验造成的人力、物力、财力的浪费。
通常，我们建议将96微孔板的前两列设置为标准品点样孔，同时设置8个梯度浓度，2列复孔，将标准品工作液由低浓度到高浓度、依次从下至上加入酶标板中。
微孔板条的后10列可设置为待测样品点样孔，一般设置2个复孔。根据实验需求，可设置正常组、模型组、治疗组等。



ELISA初始数据判读
►精密度：体现测量数据的再现性。精密度一般用变异系数CV（CV=标准差/平均值×100%）表示。一般情况下，标准品和样本OD值的CV均应≤10%。


►OD值：空白孔OD值≤0.1（夹心法）；标准品最大OD值≥1.2。样本OD值应落在标准曲线范围内。
►线性范围：标准曲线的线性回归相关系数R2≥0.99。



ELISA实验结果计算
作为ELISA实验的最后一步，检测结果的计算对整个实验十分重要。
我们以夹心法为例，来介绍ELISA实验结果计算。

● ELISA的样本通常要设置1~2个复孔进行检测，分别求出标准品、实验组样本吸光度的平均值。单个样本的检测值不应超出平均值的20%；
● 样本的OD（吸光度）平均值要减去标准品浓度为0时的OD平均值；
● 建立标准曲线：在对数坐标图上拟合四参数的逻辑函数曲线（X轴上为标准品浓度，Y轴为对应的OD值）。推荐使用origin软件。


Origin软件可自行百度下载，或点击此链接下载安装包

详细步骤如下：
第一步：输入标准品浓度和OD值


第二步：选择拟合曲线类型——非线性曲线拟合
选中输入的数值框，按如下操作依次点击选项。


第三步：选择Statistics和Logistic，勾选“Find X from Y”
完成上述操作后，点击Fit按键，拟合曲线和相关信息将自动生成（如第四步所示）。




第四步：查看标准曲线信息（如参数值，R-Square等）


第五步：修改横纵坐标标题，设置坐标轴类型为对数
双击第四步中的拟合曲线图，对其进行编辑。双击修改横纵坐标的标题，双击X轴、Y轴，设置坐标类型为“Log10”，并设置横纵坐标范围。


第六步：根据标准曲线计算样品浓度
选择第四个工作表（Fit NL Find X from Y1），在左列输入样本的OD值，对应的浓度将在右列自动生成。


ELISA夹心法和竞争法的标准曲线图


注意：
如果样本的OD值超出标准曲线的上限，请在实验前适当稀释样本，以获得精确结果。分析数据时，样本实际浓度应为标准曲线上获得的浓度乘以稀释倍数。

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