保姆级别qRT-PCR从理论知识（△Ct，△△Ct，2^-△△Ct）到实践操作

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1 背景知识介绍

1.1 qRT-PCR原理与应用

实时定量反转录PCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR)是PCR技术的一项重大发展，它能够对PCR过程中每个周期产生的产物进行可靠的检测和定量检测。在引入寡核苷酸探针（qPCR引物）后，使得这种技术成为可能，寡核苷酸探针被设计用于在目标序列内杂交。由于Taq聚合酶的5'核酸酶活性，在PCR过程中探针的切割可以用来检测目标特异性产物的扩增 [1]。
定量逆转录聚合酶链反应（Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction），也称为RT-qPCR，用于检测和定量RNA [2]。在qPCR中，扩增产物的数量在每个PCR反应周期使用荧光值被测量。利用的底物或者模板是cDNA (complementary DNA, cDNA)，而cDNA是Total RNA（总RNA）或mRNA首先转录合成。然后将cDNA用作qPCR或实时PCR反应(qPCR)的模板，RT-qPCR用于多种应用，包括基因表达分析、RNAi验证、微阵列验证、病原体检测、基因检测和疾病研究等，是非常常见和通用的一种生物科学实验技术。
对于qRT-PCR称呼有不同的形式，但总体上来说成为实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR）可能精细一些，毕竟qPCR仪器在采集数据的时候就是一种实时荧光数据收集，当然并不否认定量逆转录聚合酶链反应的称呼是错误的。
1.1 cDNA

cDNA是一种由mRNA逆转录而来的DNA（有单/双链两种情况），通常用于研究基因表达和克隆。cDNA是单链还是双链得根据实际情况，例如RT-PCR, 3'或5' RACE，我们只使用单链cDNA(第一链cDNA)，其它情况如构建表达载体，qRT-PCR等是双链。一般情况下，cDNA它是在体外经过逆转录后与RNA互补的DNA链（可以参见转录试剂盒的说明书），但是与基因组的DNA复杂序列不一样，因为cNDA来自于mRNA，因此cDNA只有外显子，因为mRNA是通过DNA转录而来，内含子序列或者绝大部分内含子序列已经被丢弃（这原理就是mRNA的剪切作用）。



（图1 cDNA合成示意图）

1.2 qRT-PCR反应

qRT-PCR反应主要包含四步：首先是双链cDNA结合染料的嵌入；其次是32P探针的标记；接着是用荧光染料标记探针；最后是记录荧光值。
这里主要是运用到Taqman实验技术，该方法利用taqdna聚合酶的5'端内切酶活性，在PCR过程中切割寡核苷酸探针，从而产生可检测信号。探针在其5'端被荧光标记，并且在其3'端通过化学修饰不可扩展。



（图2 qRT-PCR检测基本原理图）

1.3 qRT-PCR专业术语（Nomenclature）解读

基线（Baseline）：被定义为PCR周期，其中报告荧光信号正在积累，但低于仪器的检测极限。
ΔRn（时间点荧光增量）：是每个时间点荧光信号的增量，ΔRn值与循环数关系（S型）。
阈值（Threshold）是根据基线可变性选择的任意荧光水平，检测到高于阈值的信号被认为是实信号，可用于定义样本的阈值周期(Cycle threshold, Ct)。阈值可以对每个实验进行调整，使其在所有图中都处于指数放大区域。
阈值周期（Cycle threshold, Ct）是定义为报告荧光大于阈值的分数PCR循环数。Ct是实时PCR的基本原理，是产生准确和可重复数据的重要组成部分（相对表达量的直接数值，可以认为是最关键数值，平时大家在qRT-PCR中直接关注的数值）。



（图3 实时荧光定量反转录PCR工作示意图）

2 定量qRT-PCR实操

2.1 qRT-PCR布板

我们以96孔板，6个生物学重复，4个基因，内参以β-Actin为例进行布板：



表1 qRT-PCR布板

2.2 qRT-PCR上样

qRT-PCR加样的体系具体参考试剂公司提供的SYBR qRT-PCR提供的试剂说明书，但是我们一般要准备的是引物（上游引物 & 下游引物）以及cDNA模板和ddH2O,在此我们以SYBR mix，10 μL体积为例进行加样。                                                  



表2 SYBR Mix qRT-PCR加样体系

2.3 qRT-PCR上机

qRT-PCR的扩增程序类似与RT-PCR，主要包含变性-退火-延伸三步，qRT-PCR特殊的一点是在延伸（退火/延伸-两步法糅合在一起）进行了荧光数据的采集，以及多了最后一步的溶解曲线数据采集（仪器默认设置）。



表3 qRT-PCR扩增程序

2.4 数据计算

qRT-PCR的数据计算通用规则是2^-△△Ct计算规则|：
即：△Ct=Gene Ct – β-Actin Ct；
△△Ct=△Ct - 参考△Ct（一般选择对照组△Ct为参考）
下边以一个对照组和一个处理组（Treat），使用Excel进行计算为例:



表4 qRT-PCR定量数据处理

表中数据解释：
Gene Ct即基因采集到的循环阈值，有的仪器上显示Cq（q前边原理以讲解），β-Actin原理与Gene Ct一样；△Ct=gene Ct -β-Actin Ct；参考△Ct=NC △Ct均值；△△Ct=△Ct- 参考△Ct；相对表达量即2^-△△Ct：Excel输入方法“=power（2，-△△Ct）”(注意数值就是G列数值取负数)或输入“=2^-△△Ct”，^是输入法在英文状态下同时按住shift+6（6的上边就有^）即可；
t-test：在这里采用的非配对t检验，Excel输入方法：
选择检验函数：找到excel的函数fx（BCC处），然后选择 “TTEST”（图4红框标记）



（图4 excel中t-test检验的选择方式）



（图5 选择需要选择检验的两组数据。F3:F8是对照组，F9:F14是处理组，tails=2表示双尾，即不知道显著性的情况下，type=2一般我理解为非配对的t检验模式，当然图中也有注解）

t-test检验数值=8.04444E-13，即小于0.05，两组数据具有统计学差异。
2.5 图形化数据

这里就不再讲解了，常规作图，1直接使用Excel；2使用origin；3使用GrapdhPAD。
2.6 结束。

（爱自己！！！做科研!!! 每文格言“村上春树曾在书里写道："不管全世界所有人怎么说，我都认为自己的感受才是正确的，无论别人怎么看，我绝不打乱自己的节奏，喜欢的事自然可以坚持，不喜欢的怎么也长久不了。”如果有用，关注楼主GBhouse，点赞+讨论是博主持续更新的动力！！！）


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