PCR技术的前世今生

心中u你

“进化”一词并不陌生，但从哪说起呢？



小朋友们看数码宝贝时知道了，
太一要想打败更强大的数码怪兽需要
亚古兽进化、超进化甚至究极进化；
同学们从达尔文那听说了，
人类为了适应地球环境的变化，
通过几千年的演变、进化，
获得了与当今时代契合的形体与头脑。
众所周知，人类的进化需要一个漫长的过程，是以肉眼不可见的速度推进，而技术的革新着实是有目共睹的。一个人的寿命在人类进化史上短的可怜，但如此短暂的时间却可以让技术得以翻天覆地的变化。 《华尔街日报》著名作者拉里•唐斯在《颠覆定律》中指出：“技术呈指数变化，但社会、经济和法律制度仅仅在逐渐变化。”


那么具体的，技术是如何变化的呢？小诺也将以PCR技术为例，为大家概括PCR技术的“进化简史”。
PCR“进化简史”

20世纪80年代，第一代传统的PCR技术被发明出来，这一方法成为生命科学研究领域中最基础和最常规的实验方法之一，通过采用琼脂糖凝胶电泳的方法来对PCR产物进行分析，但这一方法主要适用于定性和半定量研究。
在20世纪90年代初出现了第二代的定量PCR（quantitative PCR，qPCR）技术，通过在反应体系中加入荧光染料，检测反应中发出的荧光信号达到阈值的循环数即循环阈值（cycle threshold，Ct）来计算目的酸序列的含量。qPCR技术因其快速、简易和经济的特点，目前仍被各实验室广泛地使用。但qPCR技术所谓的“定量”仍然是相对的，依赖于Ct值和标准曲线。qPCR在目的序列含量低、表达量差异十分微小、 反应体系中含大量背景序列或抑制物等情况下，灵敏度和精确度都受到很大限制。
在这种背景下，第三代PCR——数字PCR（digital PCR，dPCR）应运而生。
dPCR技术将如何操作？



dPCR的操作原理并不复杂。首先，dPCR把反应体系均匀分配到大量反应单元中，每个反应单元中不包含或包含一个到多个目的核酸序列，目的核酸序列的数量符合泊松分布。然后在每个反应单元中独立地进行PCR扩增。扩增结束后， 检测每个反应单元的荧光信号，最终根据泊松分布和荧光信号阳性的反应单元占所有反应单元的比例来计算目的核酸序列的拷贝数。在dPCR反应中荧光信号的产生过程基本与qPCR相同。
dPCR技术将带来哪些优势？
高灵敏度
dPCR本质上将一个传统的PCR反应变成了数万个PCR反应， 在这数万个反应单元中分别独立检测目的序列，从而大大提高了检测的灵敏度。
高精确度
dPCR通过计算在数万个反应单元中阳性反应单元数量和比例， 可以精确地检测出变化很小的目的序列差异。
高耐受性
dPCR技术第一步反应体系分配的过程，可以使背景序列和PCR反应抑制物被均匀分配到每个反应单元，而大部分反应单元中并不含有目的序列，低丰度的目的序列被相对富集于某些反应单元中，从而显著地降低了这些反应单元中背景序列和抑制物对反应的干扰。
绝对定量
PCR直接计算目的序列的拷贝数，无需依赖于Ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测。
数字PCR将火在哪些领域？
稀有突变检测
在大量野生型基因存在的情况下精准地检测低含量的突变基因是目前的研究难点之一，竞争性反应严重影响突变基因的检测。而dPCR技术从背景序列中检测低丰度目的序列的能力和高灵敏度的特点使得这一技术特别适合在复杂背景中检测稀有突变。
拷贝数变异分析
拷贝数变异（copy number variations，CNV）研究需要极高的定量精度以区别不同拷贝数之间的微小差异，而dPCR具有高精确度的特点，通过精确计定量目标基因与参照基因，并计算它们的比值，从而得到目标基因的拷贝数，对不同拷贝数的分辨精度远高qPCR和测序。
复杂样本基因表达检测
血液、粪便、食品、土壤等样本中含有大量PCR反应的抑制物，极大地影响 了PCR反应效率。另外，在某些检测中，难以制备测定标准曲线所需的标准物质。dPCR不受PCR抑制物的影响、不依赖标准曲线的优势，使其特别适合于这些复杂样本中基因表达的准确定量检测。
来源：诺赛基因


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