免疫荧光背景太高了怎么办？

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大家在操作时可以通过设置对照，帮助我们迅速判断背景的来源。对照包括自发荧光对照（无一抗、二抗）和无一抗对照。
1. 封闭不足

• 选用二抗种属来源的血清封闭。
  
• 选用链霉亲和素/生物素系统，需要用链霉亲和素封闭内源的生物链酶。
  
• 选用HRP系统，需要使用过氧化氢等商业化试剂盒去活化内源性HRP。
  
• 选用AP系统，需要使用左旋咪唑等商业化试剂去活化内源性磷酸酶。
  

2. 一抗
一抗浓度过高，减少用量
3. 二抗

• 设置无一抗对照，帮助确认背景是否来源二抗。
  
• 二抗浓度过高，减少用量。
  
• 抗体凝聚，使用二抗前离心去掉抗体凝聚物。
  
• 使用高交叉吸附的Alexa Fluor Plus二抗，信噪比比Alexa Fluor提高4-5倍。
  

4. 自发荧光

• 设置自发荧光对照，确定是否自发荧光。
  
• 固定剂如醛类和氨基共价结合导致的自发荧光，可用硼氢化钠去除。
  
• 增加固定剂的漂洗次数。
  
• 避开背景高的波段，选用背景较低的波段检测。
  

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