张锋最新 Nature 论文改造出全新蛋白质定向递送系统，可能为基因治疗带来哪些变革？

奋斗的小鸟

2023年3月29日，CRISPR基因编辑先驱张锋教授及其团队在 Natrue 期刊发表了题为：Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system 的研究论文。
在这项最新研究中，张锋团队通过AlphaFold辅助蛋白质设计开发了一种蛋白质递送系统——改造、利用独特的细菌“注射器”将蛋白质注射到人类细胞中。这种新型蛋白质递送方式或将改变基因治疗、癌症治疗等前沿疗法格局，具有强大的应用前景。



论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-023-05870-7

原文地址：https://www.zhihu.com/question/592870576

清风寡欲

这个新闻看到有一阵子了，给我的震撼还是蛮大的，鉴于其他答主已经对该技术进行了非常详细的解读，这里我就不再针对该技术做过多赘述（我推荐 @极萨学院冷哲 和 @麻瓜 的回答，写的非常好）。我这个回答侧重谈张锋教授包括新闻中蛋白质注射器在内的两项受细菌启发的重大科学发现。
这项研究的意义不亚于当年横空出世的CRISPR-Cas9“基因剪刀”技术。而且这两项技术还都是张锋教授开发的，其来源也都是细菌和噬菌体斗法的产物。
杀不死细菌的，让细菌更强大

其实简单了解到这个新闻的朋友可能注意到了，这个神奇的注射器跟噬菌体不能说一模一样吧，至少也算是形神兼备了。



蛋白质递送系统（上）和噬菌体（下）

细菌的这种神器注射器很有可能就是细菌在漫长的演化历史上与噬菌体不断斗法，不仅没有被噬菌体彻底灭亡，反而通过“俘获”部分噬菌体的遗传物质，习得了这个神技。从而合成出这种特殊的细菌蛋白质，即蛋白质注射器。
CRISPR-Cas9系统也是如此。当噬菌体感染细菌后，噬菌体遗传物质就会进入细菌，然后开始利用细菌的细胞器合成噬菌体。但在漫长的演化过程中，一些特殊的细菌学会了把噬菌体遗传物质转化为特殊的序列，从而让自己能够“认得”噬菌体。甚至还演化出了特殊的酶（Cas），用于剪切噬菌体遗传物质，让入侵的噬菌体无法完成复制。这就相当于细菌对这种噬菌体有了“免疫力”。



1，噬菌体注射DNA遗传物质；2，细菌将噬菌体遗传物质储存为“记忆”序列；3，“记忆”序列加工成前CRISPR；4，加工成gRNA；5，gRNA和Cas蛋白组成复合体；6，复合体结合新入侵的噬菌体DNA，将其切断。

受细菌启发的颠覆性研究/治疗工具

无论是CRISPR-Cas系统也好，还是细菌注射器也罢，阐释出这种机制本身就已经是非常了不起的科学发现。而这两种细菌对抗噬菌体的特殊机制本身也有巨大的应用前景。
首先，如果我们将CRISPR-Cas系统从细菌移植到动物细胞，把gRNA序列设计成我们想要编辑的目标序列，那不就可以引导Cas蛋白把这段序列剪断吗？然后无论是我们想破坏它还是往里面插入一段新的序列，都成为了可能。


此前闹得沸沸扬扬的贺建奎基因编辑婴儿案就是用的这个技术。
如何看待媒体报道称世界首例免疫艾滋病的基因编辑婴儿在中国诞生，是否属实？具有怎样的意义？猪心移植给人的新闻中使用的猪心也并非普通猪的心脏，而是利用该技术进行了基因编辑的猪，从而在免疫学上更像人类的心脏，从而避免超急性和急性排斥反应，同时切掉了猪基因组中的一些可能在人体中“复活”的病毒序列。
如何看待全球首个接受猪心脏移植病患死亡，距进行手术不足 2 个月？可能是由哪些因素导致？


杨璐菡使用CRISPR-Cas9技术清理了猪基因组中潜在的病毒序列

而张锋教授的最新发现——蛋白质注射器则是另一种有重大治疗意义的潜在工具。
这种特殊的蛋白质本身长得就像注射器——针筒+药液。


其中蓝色和紫色部分就是针筒，而红色橙色部分就是“药液”。只不过在细菌中找到的原始版本装的是让细胞死亡的毒蛋白，我们只需要修改这段序列，就可以让注射器装载我们需要的药液，完成我们需要的工作。
而这个注射器的“针头”则无意识最精妙的部分——它有识别能力。张锋教授通过一种推算蛋白质空间结构的AI工具——AlphaFold设计出能够与目标受体完美结合的序列，然后用它替换掉注射器原有的针头，这个注射器就可以“扎到”需要的细胞，而对其他细胞不起作用。提高了治疗的精准度，避免了治疗的副作用。



利用AlphaFold设计“针头”

重大变革的前夜，生逢其时的工具

前段时间，我解读了另外一篇最新文献，从筛选治疗靶点到推算靶点蛋白质空间结构，再到设计化学分子、分析亲和力的一整套药物研发流程AI都可以完成，而且即使加上细胞和动物的实验验证也仅仅耗时30天，创造了一个“药物”（因为还没有通过临床试验，所以要加引号）开发的速度记录。
研究人员称 AI 仅用 30 天研发出潜在抗癌新药，并能预测患者的生存率，能给医学带来哪些影响？无独有偶，张锋教授在为蛋白质注射器设计“针头”的时候再次用到了AlphaFold，所以靶向序列的设计速度大大加快了。
无论是基于CRISPR-Cas9技术的基因治疗，还是未来利用蛋白质注射器直接把活性蛋白导入到目标细胞，AI都可以加快序列设计、靶向分子结构设计的速度。在可以预见的将来，基于这两项技术的研究，甚至是药物开发计划将在AI的帮助下以极快的速度涌现出来。
很多创新的治疗方法都需要大量实验加以试错，而尝试的越多越快，找到靠谱方法的概率也就越高。
就如同细菌面对噬菌体的入侵，在无数次的细菌分裂复制过程中，一些特殊的细菌练成了对付噬菌体的CRISPR大法，有些则“偷走”了噬菌体的“神兵利器”为己所用。

同花顺

好的工作有用、有趣、聪明，这个工作三者具备。
我讲讲这个工作为什么好玩：
首先，这工作偷师于自然[1]。
自然界中，细菌会释放一些小玩意儿调控宿主细胞。有一种长得像针管一样，叫作收缩注射系统（contractile injection systems，CIS），会把“针管”里的“子弹蛋白”打到宿主体内。
比如这里的“子弹”是毒蛋白PDP1，会导致宿主细胞死亡。


如果把“子弹”换成治疗蛋白，不就可以治病？
如果把“毒蛋白”靶向癌细胞，不就可以杀癌？
虽然这个系统很有应用价值，但它目前的子弹和靶向细胞都不太对，想用到人身上得做些改造：

1.子弹上膛：怎么把其他蛋白装进针管？


这个针管本身装载一种叫“PDP1”的蛋白，这是个毒蛋白，打到昆虫细胞Sf9里，细胞就死了。
PDP1毒蛋白有一段PD结构域，会被识别装载到“针管”里。如果把这段PD结构域融合到想递送的蛋白上（比如表达一个PD-GFP绿色荧光蛋白)，针管就能装其他子弹。打进细胞，细胞就能发绿光。
所以，PD-融合蛋白首先解决了“子弹”上膛问题。

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2.子弹怎么瞄准靶标细胞？
这个针管有触角，叫作PVC13，“触角”能识别靶标细胞的，像这里的PVC13就靶向昆虫细胞。
怎么靶向人的细胞呢？
如果把针管的“触角”PVC13改造一下，连接能识别人细胞的蛋白AD5-KNOB结构域，或者连接能识别人肺细胞EGFR受体的抗体蛋白，会不会使“子弹”打向人的细胞？
果然，改造之后，针管从打昆虫细胞变成打人的细胞。
如果针管装上毒蛋白PDP1，人细胞就会被打死。



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3.应用环节：“子弹”打向小鼠神经元
子弹上膛研究好了，做一个PD-融合蛋白就行。
子弹射向谁也研究好了，针管触角上加个靶向蛋白就行。
下面就到应用时间：
“子弹”用CRE蛋白，“针管”触角改成靶向小鼠神经元的Ad5(RGD/PK7)，就能把CRE送进神经元，显示出红色，特异靶向哺乳动物的神经元，而不会靶向小胶质细胞。


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4.更广阔的应用：
工作做到这里，概念就证明完了。
这个工作除了让小鼠神经元变红，还有其他用吗？
其实应用价值很大，如果“针管”打一些治疗蛋白就可以治病。比如“针管”装上基因编辑工具ZFN，就可以直接编辑特定细胞，治疗一些遗传疾病。
而“针管”装一些毒蛋白，就可以毒死癌细胞。
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5.优缺点：
这个系统比较AAV之类的病毒递送系统来说，一个好处是“针管”和“子弹”都可以组装，生产成本有机会做得很低；另一个好处是“针管”上的受体可以调整，靶向细胞的类型非常灵活。
而这个系统的缺点是免疫原性，“针管”蛋白不是人源的，会被人免疫排斥，目前大概率不能重复给药。

<hr/>总的来说，这工作又有趣（偷师自然），又聪明（大量改造），又有用（可以治病）。
三项占一项就不错了，占全三项，是一流的工作。

长长的路

说来惭愧，这论文还是学生先发给我的，让我一起来膜拜大佬，然后我真的膜拜到了半夜。
先说结论，这技术是一个不亚于CRISPR的技术，可以说是一个能改变生物工具箱的技术。这技术不管是用在基因编辑，生物医药，甚至癌症治疗上，都有大用。
再加上张峰在21年开发的那套叫做SEND的RNA递送系统，这都可以和eCIS系统结合，做成一个CRISPR组合包了。


甚至我怀疑，这两个技术本身，就是张峰为了拓展CRISPR的应用开发的。
来聊聊这个新发现。
靶向递送一直是一个困扰生物学，尤其是医学的问题。
我们近些年所倡导的精准医学里边，一方面是针对于不同基因型采取不同用药方式，而另一方面就是针对不同的疾病和病灶，采取精准用药的方式。
比如说传统的用药方式那就是地毯式的轰炸，而精准用药就是精确制导导弹。
比如张峰的的CRISPR/Cas9工具特别好用，但存在的问题是，怎么把基因编辑工具靶向性的递送到关键的细胞里。
在之前我们也开发过很多靶向药系统，比如最常见的被动靶向药物释放系统。
被动靶向药物释放系统依赖于生物体内的生理和病理过程来实现药物的定位。例如，肿瘤组织通常具有异常的血管结构和增强的血管通透性，这使得药物在肿瘤组织中更容易聚集。这种现象被称为增强渗透性和保留效应（EPR效应）。很多纳米脂质体（LNP）递送技术就依托于这个原理。
所以为啥治疗肝病的靶向药物这么多呢？因为LNP很适合靶向肝脏。
看原理就知道，这种靶向方法精准度不高，而且局限性很大。
所以人们就更期待主动靶向药物释放系统，主动靶向药物释放系统通过在药物载体表面修饰具有高度特异性的靶向分子，使得药物能够精确地作用于特定的靶细胞或组织。
主动靶向看起来很美好，但是问题也很多，比如靶向分子不好找，靶向难做。再比如制备复杂，成本高。还有免疫原性问题，体内稳定性问题，细胞内释放效率问题以及能否做针对性改变的问题。
张峰这次开发的，就是一种主动靶向递送系统，而且具有几个特别强的优势：效率高，可编程，免疫原性低，安全性高，代谢快。
几乎就是一款“接近于完美”的蛋白递送系统。
与CRISPR系统类似，细胞外可收缩注射系统（eCIS）也是来自于自然界中的已有的生物中的独特的功能体系。
对于自然界的一种特别的生物，内功生细菌，是一种与宿主细胞形成紧密共生关系的微生物，通常生活在宿主细胞内部。这些细菌经常需要分泌调节宿主生物学有利于共生体适应性的因子来调控宿主，但这些因子（蛋白质）很难穿过细胞膜，所以内共生菌进化出了一套类似于噬菌体尾部的注射系统的功能来传递调控因子。


这玩意是不是神似下边的这个噬菌体结构？


要不咋说大自然很神奇呢？
而张峰团队就是基于这一个原理，进行了深入的研究，他们选择了自发光杆菌属的一种线虫共生菌，将它的eCIS命名为Photorhabdusvirulence cassette（PVC）。
PVC这东西本来就是用来运送生物毒素的，显微镜下是这样的。


我们把他的结构抽象出来是这样的。


那么，PVC是如何靶向细胞的？问题就出现在这家伙的脚上。
这个脚，就像是一个导弹的导航系统一样。这时候张峰团队的脑洞就来了，那如果我们修改一下这个脚的结构，是不是就可以按着我们所设计的目标去导航了？
事实证明，这玩意真的可以。张峰团队用AlphaFold设计和编程了几个Pvc13（尾纤维）的结构进行体外实验，靶向人体细胞，这里参照的Ad5（一种人体可感染的腺病毒）的结构，惊人的结果是，真的好用。而且效率惊人的高，几乎是100%。而且准确率非常高，几乎没什么脱靶的。


接下来又做了小鼠的体内实验。他们又用AlphaFold设计出一个可以用在小鼠神经元细胞的靶向蛋白，然后把这个做出来以后注射到了小鼠的海马体内。


结果一样说明在体内这套系统依然可以运行，同时在后续的实验中发现，PVC靶向的目标基本都集中在神经元中，说明实现了对神经元细胞的靶向非常好。
而且在体内实验7天后，没有观察到小鼠的炎症反应，小鼠没有发生体重减轻的变化，以及，检测不到PVC的存在了。
这意味着，PVC这东西，在小鼠体内，没有引发什么免疫反应，而且都顺利的代谢掉了。
安全，有效，代谢快。
这东西，就像是给生物学家打开了一个新世界的大门。
一个可以根据目标不同，进行编程的蛋白递送系统，而且可以递送上百KD的蛋白（Cas9有170多KD），同时具备了高效，安全，低免疫原性，还代谢快这些特性，所以我前边说这几乎是一个接近于完美的蛋白递送系统。
而且不要忘了，这才只是一个共生菌里的，那么多共生菌呢？这就是给全世界的生物学家打开了一个新世界的大门啊。
这次让我们再次期待张峰获得诺贝尔奖的消息吧。
膜拜大佬。

长长的路

基因编辑领域先驱张锋教授团队在顶尖学术期刊《自然》上发表最新研究，带来了一种全新的蛋白递送系统，它具有将任何蛋白精准递送到任何指定人类细胞的潜力，有望解决基因疗法、癌症药物递送等多重挑战。
利用这一系统，研究团队还成功地在小鼠体内将蛋白质送入了活体小鼠的大脑中，并且发现没有诱发局部免疫反应，这也意味着这套递送系统有望在将来安全地用于向人类递送基因疗法。
《自然》同期刊发的专家评述指出，这套递送系统是“一个令人兴奋的生物技术工具箱，其可定制性为多种生物医学应用打开了大门”。
<hr/>目前，基因疗法的递送通常使用两大类方式：脂质纳米颗粒（LNP）或病毒载体。这两种方式都具有各自的局限性，比如LNP通常聚集在肝脏中，常用的腺相关病毒载体载荷大小有限。这些局限性是限制基因疗法广泛用于治疗肝外疾病的原因之一。
这项突破性递送技术的灵感来源于大自然中的细菌。在自然界，噬菌体是一种专门在细菌中繁殖的病毒，它能够识别特定种类的细菌，然后通过与细菌表面的受体相结合，将自身的基因组像打针一样注射到细菌体内。而有些细菌在被噬菌体感染了之后，学会了利用这套元件，用于将自身生产的毒素注射到其它动物的细胞中。比如昆虫致病菌发光杆菌（Photorhabdus），就会利用这套注射系统，将毒素注入昆虫细胞并将细胞杀死。
借鉴大自然的灵感历史上已经催生了多种突破性生物技术，比如我们熟知的CRISPR-Cas9基因编辑系统，就是来源于对细菌对抗病毒的“免疫系统”的改造。张锋教授团队此前也借鉴人体细胞中天然存在的逆转录元件，开发出全新的mRNA递送技术。




▲张锋教授领导了这项最新研究（图片来源：张锋教授实验室主页）

这一次，研究人员的目标是将细菌中存在的注射系统改造成精准递送工具，识别不同种类的人类细胞，并且将治疗蛋白注射到细胞内。
利用人工智能平台AlphaFold，研究人员解析了细菌中称为细胞外可收缩注射系统（eCIS）的蛋白复合体的结构。这个复合体与我们常用的注射器有些相似，像针筒一样的柱状结构携带着需要注射到细胞内的蛋白质“货物”，一端的尾部纤维能识别细胞表面的特定受体并锚定在细胞表面，然后收缩系统将“针头”刺入细胞内，递送蛋白载荷。研究人员通过对尾部纤维的修改，可以让它们精准地靶向人类细胞表面表达的不同蛋白。




▲重新设计细菌的胞外可收缩注射系统，将其改造为专门靶向特定人类细胞递送所需蛋白质的装置（图片来源：参考资料[4]）

在体外细胞培养实验中，研究人员设计的一种eCIS可以将杀死细胞的毒素精准递送到高度表达EGFR受体的细胞中，杀死了几乎100%的EGFR阳性细胞，却没有影响到不表达EGFR的细胞，体现了这一系统的强大特异性。
而且，通过对eCIS的进一步改造，研究人员可以使用这一系统递送不同类型的蛋白载荷，他们已经在体外实验中成功递送了CRISPR基因编辑系统中的Cas9蛋白以及另一类用于基因编辑的锌指蛋白。
在小鼠的体内实验中，这种经过改造的递送系统也可以将蛋白递送到小鼠大脑的神经元中。佐治亚理工学院专注于开发LNP递送系统的James Dahlman教授在接受行业媒体STAT采访时表示，未来它可以开发成为一套高度可编程的递送系统，将不同的载荷精准递送到指定的人类细胞中。




▲改造的蛋白递送系统在小鼠模型中完成靶向递送（图片来源：参考资料[3]）

“治疗分子的递送一直是医药领域的主要瓶颈，我们需要广泛的递送选择来将有力的创新疗法递送到人体中合适的细胞里。”张锋教授表示，“通过学习大自然中的转运蛋白，我们能够开发一种全新的技术平台来填补这一空白。”

参考资料：
https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzAwMDA5NTIxNQ==&mid=2650052513&idx=1&sn=a1299545c8636265723352353c971ba7&chksm=82ee1121b5999837aa1924582f5833ccc1dec216d3d9067959a18ba0fcc02129133875407f31#rd
https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI5MDQzNjY2OA==&mid=2247535262&idx=1&sn=3621ae9b9587dbe9e14bda6e533969b2&chksm=ec1de9cddb6a60dbdb66649cf5479c006d58b3442aa256e0ecb30fc9a01b1bf684692631a738#rd▎药明康德内容团队编辑
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继续前进

一个字，牛！
一句话概括就是：
他创造了一种可编程的微型注射器（尺寸仅为100纳米），能将蛋白类药物甚至毒素运送到特定的细胞中，效率接近100%。
形象地说，它就是带有精确制导系统的微型注射器。
自然界中有一类细菌名为Endosymbiotic bacteria，能够通过尾部的特殊结构（以下成为PVC)，将细菌内容物注射到宿主细胞内。


但是，这种细菌一般不能感染人类细胞。早些年有人发现一个突变体能够感染小鼠细胞，张锋团队表示很感兴趣。于是他们就首先分析了一下，为啥这个细菌的PVC能够将内容物注射进宿主细胞。


于是他们就发现，PVC内部有一个管道，从尾部发出。尾部有毛状结构，但其实只是蛋白结构的延伸。
比如，这个PVC尾毛就是有很多蛋白组成的，绝大多数蛋白都是保守的，不能变，只有六个左右的蛋白，改变以后不会对PVC结构有太大影响。
他们仔细研究了尾毛蛋白整体的结构，并通过Alphafold重新设计那六个可变蛋白，神奇的事情发生了，PVC竟然能在尾毛的带动下去往特定的目的地。
原来，尾毛蛋白是通过三维结构与相应的目标蛋白通过蛋白与蛋白之间互相作用，识别。
鉴于很多细胞表面都有独特的蛋白，那么通过Alphafold设计出能与之结合的相应尾毛蛋白，不就能靶向递送了？
事实确实如此。
研究中他们使用了人类免疫T细胞，以及一种癌细胞。他们将PVC尾毛蛋白设计为能够特异结合癌细胞表面特异的一种蛋白，然后往细菌里导入毒素，细菌就像收到指令一样，直接奔向癌细胞。
他们又在小鼠模型中做了类似实验，不同的是，他们将细菌设计好以后，配制成注射液，直接注入小鼠颅内。

<hr/>这项研究可谓目前人类前沿科技的集大成者，并将变革现有的药物递送模式，将靶向药的研究和应用往前推了一大步，并且具有极其广泛的应用价值。
比如，攻克癌症，制作将包含毒素的细菌，设计能定位癌细胞的尾毛蛋白，定向杀死癌细胞。
比如，精确的基因编辑。将碱基编辑器送入目标细胞。
比如，糖尿病。晚期糖尿病必须注射胰岛素，如果有了新的细菌，那么PVC会把胰岛刺激物质带入胰脏促进胰岛细胞再生。
<hr/>不过，目前来说，要解决的问题还有不少。虽然该细菌主要感染昆虫，但PVC会不会引起人类的免疫反应？
目前递送的蛋白最大为200kd左右，且一次只能递送一种。比如CRISPR-Cas9基因编辑系统有Cas9和sgRNA两种组成，但该细菌目前并不能同时递送，无法实现基因编辑。
<hr/>有人说，它不就跟噬菌体一样嘛？
其实大不一样。
噬菌体作为病毒，注入的是RNA或RNA片段，且噬菌体暂时还为体现出可被重编程，以特异地靶向特定目标的能力。
但细菌PVC不一样，它能被编程，被设计，而且是通过经典的蛋白与蛋白相互作用进行特异性结合。
如果说CISPR-Cas9基因编辑技术是"基因魔剪"，那PVC可谓"神之注射器"（尺寸仅为100nm）。
<hr/>另外，本文的第一作者是一位MIT生物工程系的在读博士。