Elisa实验步骤整理

非诚勿扰孟非

Elisa原理

Elisa本质上是利用了抗原和抗体的特异性结合反应将待测物和酶连接，通过酶与底物产生颜色反应来定量检测样品中目的蛋白浓度。
Elisa常见类型
直接法：将抗原固定在板上，用酶标抗体直接检测抗原。
间接法：将抗原固定在板上，先加入检测抗体和抗原特异性结合，然后加入酶标二抗和底物显色。


夹心法：将捕获抗体固定在板上，与抗原结合后加入捕获抗体，之后和直接法或间接法类似，区别在于捕获抗体是否酶标记。
竞争法：将抗体固定在板上，一组加入样品和酶标抗原混合液，另一组加入酶标抗原，样品中的待测抗原越多，能竞争掉越多的酶标抗原，输出信号越弱。故输出信号和样品中待测抗原浓度成反比。

Elisa类型	优点	缺点
直接法	操作简单，不使用二抗避免交叉反应	标记一抗成本高，不使用二抗无信号放大
间接法	成本低，二抗放大信号	使用二抗，交叉反应几率增加
夹心法	特异性强，灵敏度高	抗原必须有至少两个表位
竞争法	可适用于低纯度样本	敏感度较差

Elisa试剂配制
1. 包被缓冲液（PH9.6 0.05 M碳酸盐缓冲液）
NaHCO3   1.59g
NaHCO3　 2.93g
调pH值到9.6，加蒸馏水至1000 ml
2. 洗涤缓冲液（PH7.4 0.15 M PBS）
KH2PO4 　　　　 　0.2g
Na2HPO4·12H2O　 2.9g
NaCl　　　　　 　　8.0g
KCl　　　　　　　  0.2g
Tween-20　0.05%　  0.5 ml
调pH值到7.4，加蒸馏水至1000 ml
3. 稀释液
BSA 0.1g
加洗涤缓冲液至100ml
4. 底物缓冲液
0.2 M Na2HPO4(28.4g/L)  25.7 ml
0.1 M 柠檬酸(19.2g/L)　　24.3 ml
加蒸馏水50 ml。
5. TMB使用液（配好后立即使用）
TMB（10mg/5ml无水乙醇）0.5ml
底物缓冲液 10ml
0.75%H2O2 32μl
6. 封闭液
BSA 5g
加洗涤缓冲液至100 ml
7. 终止液
把108.5ml浓硫酸缓缓加入891.5ml蒸馏水中，边加边不断搅拌
Elisa操作步骤
1. 包被
用包被缓冲液稀释包被抗原至5μg/ml，酶标板中每孔加入50μl，37度过夜包被。
2. 洗涤
倒掉包被液，拍干，用洗涤液洗板3次，每次3min-5min。
3. 封闭
每孔加封闭液250μl，37度封闭2h。
4. 洗涤
用洗涤液洗板3次，每次3min-5min。
5. 阳性对照，阴性对照准备（标准品的稀释），待测样品稀释
取6只试管依次标记好1到6号，每只试管各加入150μl稀释液（若血清、血浆、组织匀浆样本，用稀释液，若细胞上清样本，建议用细胞培养基稀释），取纯化后的目标蛋白150μl（需测定好蛋白浓度，如果使用的是Elisa试剂盒这里为标准品原液）加入1号试管中，再从1号试管取150μl加入到2号试管中，以此类推，直至从5号试管吸出150μl后丢弃，将6号试管作为阴性对照。根据测得纯化目的蛋白浓度的不同，做浓度梯度前预先将纯化蛋白用稀释液稀释到一定浓度，使得1/2浓度处的标准品符合最大OD值≥1.2。另外，待测样本也需要稀释并满足特定OD值要求，落在标准品最高值OD值的半量程内，假定标准品最高值的OD值是1.2，那么稀释后的样本，OD值接近0.6，在这个范围附近，计算的浓度值最为准确，以这个结果乘以稀释倍数，得到的样本浓度最准确。


6. 结合一抗
在酶标包被板上设置阳性对照孔，依次加入不同浓度标准品50μl，最后一个为阴性对照孔，紧接着设置空白孔和待测样品孔，其中空白孔不加任何东西，待测样品孔加入50μl待测样品（都做两个平行孔）。需要注意加样不要触及孔壁，尽量加到孔底部，轻轻晃动混匀，37度孵育1.5h。
7. 洗涤
倒掉液体，用洗涤液洗板3次，每次3min-5min。
8. 结合酶标二抗
每孔加酶标二抗50μl，空白孔不加，37度孵育1h。
9. 洗涤
倒掉液体，用洗涤液洗板3次，每次3min-5min。
10. 显色
每孔加入底物溶液50μl，轻轻晃动混匀，盖上封板膜后37度恒温箱闭光显色10min。
11. 终止
揭开封板膜，加入终止液50μl，终止反应，此时颜色会由蓝转黄。



12. 测定吸光度
以空白孔调零，依序测量各孔在450nm的吸光度OD值，需要注意吸光度测定要在加了终止液15min内。



13. 结果计算（可在Excel中进行）
先计算出标准品孔（阳性对照和阴性对照），空白孔和样品孔的平均OD值，标准品孔和样品孔再减去空白孔的平均OD值调零，用调零后的标准品OD值和对应浓度拟合做标准曲线，将样本的OD值代入标准曲线中求出稀释后的样本浓度，乘以稀释倍数得出实际样本浓度。



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