【清单革命】一文看透免疫荧光

莺歌燕舞

复杂问题的程序多、专业性强，核心是避免遗漏重要环节。核查清单，能确保每个基础而重要的环节不被遗漏。                                                           
                                                                                              ——《清单革命》阿图葛文德
实验原理：
在金庸的《倚天屠龙记》中里的乾坤大挪移，是写在羊皮上的，只有沾了鲜血才会显出字来。而细胞中你想染色的蛋白也如同无字天书，我们是看不到的。我们现在蛋白（字）上面结合上一抗，可惜一抗也是无色的，再加上二抗，二抗可以和一抗结合，而且是有颜色的，于是我们就将“天书”显出了颜色。
实验步骤：

• 固定细胞：将处理好的细胞用4%的多聚甲醛在4℃下固定过夜
  
• PBS清洗两遍，加入1mlPBS，挑出爬片，置于封口膜上
  
• 通透细胞：0.2% Triton X-100 （1XPBS稀释），室温处理5min，PBS清洗三遍
  
• 封闭，用PBS稀释的1%的BSA室温封闭60min。
  
• 孵育一抗：（不用清洗），一抗（1% BSA稀释）室温孵育2h
  
• 清洗一抗：PBS清洗三次，每次10 min
  
• 前三次加上PBS直接再吸掉（清洗表面），后面加上PBS，静置10min（清洗核心）。
  
• 孵育二抗：荧光基团（1% BSA稀释），室温孵育1-1.5h
  
• 清洗二抗：PBS清洗三次，每次10min，最后使用纯水清洗
  
• DAPI染核：
  
• 封片，晾干，放置于-20℃冰箱
  
• 整理实验台
  

实验试剂：
DAPI贮存液 ：用无菌水配制成浓度1 mg/ml 的贮存液，配好后用锡纸包起来，避光，可在-20 ℃下长期保存。（DAPI易溶于水，在PBS中溶解度不高）使用浓度 ：贮存液用1xPBS稀释到终浓度100 ng/ml。
荧光封片液 ：0.5 mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合，pH9.5

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