ELISA干货|实验原理+实验步骤+注意事项

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ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
在检测时，受检标本（测定其中的抗原）与固相载体表面的抗体反应。洗涤后加入酶标记的抗体，通过反应结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
一、ELISA样本的处理
ELISA的检测目的是为了实验提供准确的实验依据，为了保证实验数据的可靠性，在实验过程中必须坚持全面的质量控制和全过程质量控制，在收集标本前都必须有一个完整的计划
注意事项
1、每个样本量收集体积=100ulx检测种类，如果要做复孔，标本量收集体积=100ulx检测种类x2
2、样本收集后若在一周内进行检测可保存于2-8°C，若不及时检测，请进行分装，冻存于-20°或-80°C，避免反复冻融
3、试剂盒的检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本。
4、血清标本采集是应注意避免溶血，红细胞溶解是会释放出具有过氧化物酶活性的物质，溶血标本可能会增加非特异性显色
5、为了保证尿液检测的准确性，必须正确收集尿液标本和保存，收集尿液的容器必须要清洁干燥，最好使用一次性的容器，避免因用药并清洁不到而造成的污染，尿液样本必须新鲜，留取后，应及时检测或保存
6、标本宜在新鲜是检测如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中可能发生聚合，间接法ELISA中乐视本底加深，
7、反复冻融会使蛋白效价降低，所以待测样本如需多次检测，宜少量分装冻存
二、标本类型
01、ELISA的常见标本
液体类标本：血清、血浆、尿液、细胞上清、脑脊液等
培养细胞
组织标本
02、ELISA标本的保存
一般来说，再5天内测定的血清标本可放置于4°C，标本再冰箱中保存时间过长会导致血清IgG聚合，是间接法的试剂本底加深，超过一周测定的需-20°C保存，冻结血清溶解后，蛋白质局部浓缩，分不均，应充分混匀并避免产生气泡，
浑浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。
测抗体的血清的标本如需保存作多次检测，以少量分装冰存，
保存血清只采集是就应注意无菌操作，也可加入适当的防腐剂，抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性，建议劲量不使用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。
03、ELISA标本的处理
1、血清：室温血液私人凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，如有沉淀形成，应再次离心
3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清：检测分泌性的成分时，用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）仔细收集上清，检测细胞内的成分时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右，通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成分。
5.组织标本：切割标本后，称取重量，加入一定量的PBS，PH7.4，用液氮迅速冷冻保存备用，标本融化后任然保持2-8°C的温度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，分装后一份待检测，其余冷冻备用，
6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行试验，若不能马上进行试验，可将标本放于-20°C保存，单应避免反复冻融。
三、ELISA的检测方法
ELISA的检测方法有直接发、间接法、竞争法基双抗夹心法，其中直接法和竞争法应用较少，应有最多的是双抗夹心法，其在敏感性基因【特异性上有明显的优势，


直接法
将抗原固定于ELISA班上，然后用酶标抗体直检测抗原。
相较于其他类型的ELISA实验，直接ELISA实验步骤少，检测速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反应，检测结果不容易出错，
但是由于直接ELISA的抗原不是特异性固定的，样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与ELISA版结合，实验背景会比较高，而且直接ELISA每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验不太灵活。另外由于没有使用二抗，信号没有被放大，降低了测定的灵敏度。
间接法
将抗原固定于ELISA班上，随后分两步进行检测：首先加入检测抗体于抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。
于直接ELISA相比，间接ELISA用到酶标二抗，具有更高的灵敏度，也需要更少的标记抗体，更经济，间接ELISA还提供了更大的灵活性，
缺点：存在交叉反应的可能性（酶标二抗直接与抗原结合），可能会增加背景，同时与直接ELISA相比，间接ELISA实验多了二抗孵育的步骤，实验周期延长。
夹心法
被检测的抗原包被再两个抗体之间其中一个抗体将抗原固定于载体上，即捕捉抗体，另一个则是检测抗体，此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量，或不标记，再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量，这两种抗体必须小心选取，才可以避免交互反应货竞争相同额抗原结合部位。

竞争法
预先将抗原包被再固相载体上，并加入酶标记的特异性抗体，实验是，加入待检抗原（或抗体），如果待检物是抗原，则待检抗原于预先包被再固相载体上的抗原竞争结合酶标抗体，如果待检测物是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被再固相载体上的抗原，通过洗涤洗掉被竞争结合的酶标抗体，最后加底物显色，需要注意的是显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比
竞争ELISA相对以上的三种方法更复杂一些，但以上三种ELISA类型都适用于竞争ELISA的形式，其主要有点在于可检测不纯的样品，且数据再现性高，但存在整体敏感性和专一性较差的问题。
四、双抗夹心法的操作步骤


ELISA实验的原理
1.包被：抗原或者抗体能以物理性吸附于固相载体表面，原因是蛋白质和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原反应等免疫活性：
2、标记：抗原或者抗体可通过共价键与酶连接成酶结合物而此种酶结合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特点：
3、显色：酶结合物与相应包被在固相载体的抗原或抗体结合后，也被固定在固相载体上，加入酶的底物之后可出现显色反应，根据反应的颜色深浅可计算抗原或者抗体的相对含量。
如何 选择ELISA试剂盒？
1.特异性：ELISA试剂盒的特异性于试剂盒的关键组分，抗体对有关，若抗体对中之一为多抗，另一个必须为单抗，建议使用双单抗，
2、灵敏度：灵敏度反映的是试剂盒检出被检物质的最低量的能力，用户可根据自己样本中待检指标的量选择合适的试剂盒，如果待检指标量很低，一般的试剂盒不能满足要求，可选择高敏的ELISA试剂盒。
3、重复性：科学实验讲求重复性，一般ELISA试剂盒，期板内和板间变异系数应该控制在15%以内。
4、简便性：试剂盒在保证高质量数据的情况下，实验时间越短，操作越便利，越容易受到用户欢迎，
五、ELISA的常见问题及解决方法

问题	可能原因	解决方法
高背景或阴性对照只偏高	阴性对照孔被阳性对照货样品污染	洗涤是，勿将洗液溢出孔外
抗体非特异性结合	封闭液不合适，更换封闭液
酶结合物过浓	请检查酶结合物是否按说明书规定稀释
孵育温度过高	检查孵育箱的温度是否正确、稳定
底物再使用前曝光	应保存再暗处、避光
读板前停留时间过长	加终止液后3分钟内读数
标准曲标准曲线良好，但样本无检测信号	样本中无检测物或检测无含量极低	设置内参，重新实验
样本中其它物质影响/掩盖检测	作适当稀释，降低其它物质的干扰，或作系列稀释，检测回收率
样本中检测物浓度过高，HOOK效应导致假低值	适当倍数稀释样本，检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内
重复性较差	微孔中有气泡	用针尖挑破气泡
试剂未混匀	确保充分混匀试剂
样本中有杂质或沉淀物	使用前；离心
微孔包被面被吸头划破	加液是小心操作
使用过的封板胶纸	每次须使用新的封板胶封住反应孔
假阳性反应	洗涤不充分	使用前需检查洗板机是否正常工作
洗板机管道堵塞	需经常维护洗板机
加结合物是，洒在微孔边缘	小心向微孔加入结合物，加入微孔底部中央，避免与孔壁和边缘接触
微孔中液体挥发	用封板胶密封反应孔，置于湿盒内
边缘效应	孵育温度不均衡	避免在环境温度变化大的地方
蒸发	确保孵育是封闭完好
酶标板叠放	避免酶标板叠放

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