流式细胞仪原理及操作方法

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流式细胞仪的三大系统

液流系统：聚焦细胞以供检测
光学系统：激发和收集光信号
电子系统：将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析
流式细胞仪的光信号

散射光信号

散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异。通常使用“散点图”来看散射光信号，散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据。



前向角散射光（FSC,Forward Scatter）:入射激光的同向散射光信号，表征细胞相对大小及其表面积。


侧向角散射（SSC, Side Scatter）:入射激光90°角的散射光信号，表征细胞粒度及细胞内相对复杂性。



荧光信号

荧光素吸收激光能量，荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能，并释放较入射光波长更长的光量子。
荧光素与特异抗体结合，荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强。根据同型对照管或阴性对照管进行设置，放大或者缩小信号。
分选原理



分选时利用电极板加电及给予待分选的液滴同时加上适量的电荷，从而使得发生液滴偏转得以将目的细胞进行富集。
操作流程

• 打开电脑，打开流式细胞仪主电源
  
• 打开激光器，预热30min
  
• 双击FACSDiva 软件图标启动软件，等待联机
  
• 在Cytometer 窗口中查看液体水平，若有必要，添加液体或清空废液
  
• 在主菜单栏点击Cytometer/ Fluid startup 启动液流，出现下列窗口
  
• 确定空气及液流系统管路和乙醇桶连接断开，并和鞘液桶连接，然后点击Done
  
• 确认closed nozzle 安装在流动室中，此时液流系统启动
  
• 用棉签蘸ddH20 将电极板擦拭干净，特别做分选前一定要保证电极板的干净。
  
• 将closed nozzle 从流动室中移除
  
• 确定所要使用的喷嘴尺寸并确定O-ring 位置，将喷嘴插入流动室
  
• 主菜单下选择Sort/Sort setup，选择喷嘴尺寸
  
• 点击工作站工具栏中分选按钮，打开断点窗口（Breakoff window），此时该窗口上方会显示喷嘴孔径
  
• 点击断点窗口上的Stream,打开液流，打开分选仓门，观察液流是否平稳流入废液槽的中心。
  

① 若液流不在废液槽中心，可用Allen 扳手调整分选仓的角度
② 若液流不稳，可能仪器系统存在气泡，断开液流，等待10 秒，再次启动液流；
③ 若发现液流有喷雾现象，或断点窗口中的液流图像异常，则：
可能是喷嘴插入位置不正确或者O 圈有磨损，断开液流，取下喷嘴，确
认O 圈位置，重插入，打开液流看是否正常，必要时可更换O 圈；
也有可能是喷嘴堵塞或损坏，此时可关闭液流，取下喷嘴，超声1-2min，
若喷嘴损坏，只能更换喷嘴。

14. 关上分选仓门，调节液流激光，使液流窗口中看到最为明亮的光斑
15. 调整液流

① 调整振幅Ampl,直到断点位于窗口的上1/3 区域
② 确定小的卫星滴和大的液滴融合，若卫星滴未融合，需移动并重新安装喷嘴，或超声清洗喷嘴
③ 在Drop1 左边区域输入右边灰色背景显示的实际Drop1 的数据作为目标值
④ 液滴稳定后，启动Sweet spot

运行样本分析

• 选择实验所需的流式细胞仪配置，即configuration, 必要时需创建新configuration
  
• 点击工作站工具栏中相应按钮显示浏览器显示浏览器Browser，流式细胞仪Cytometer，视察器inspector，工作表worksheet和数据采集仪表盘Acqusiton Dashboard窗口。
  
• 在浏览器Browser 窗口新建文件夹，在此文件夹下创建实验
  
• 创建新实验有两种方式：
  

a. 直接点击工具栏中New Experiment 的按钮，这种方式只单纯建立一个新的空白实验，Specimen 和Tube 仍需新建，见步骤2.4 2.5
b. 在主菜单中选择Experiment / New Experiment, 出现以下对话框，选择Blank Experiment with sample Tube，这种方式建立的空白实验下还建立空白Spicemen 和空白Tube

5. 在新建实验下新建Specimen，同样可直接点击工具栏中New Specimen 图标，也可在主菜单中选择Experiment / New Specimen
6. 在新建Specimen 下新建Tube, 可直接点击工具栏中New tube 图标，也可在主菜单中选择Expeiment / New Tube
7. 在Cytometer 窗口Parameters 界面下，选择所需荧光参数，若有不需要的多个参数，可按住Crtl 选中，点击Delete, 若需添加，点击Add，选择参数即可
8. 主菜单Experiment / Experiment layout 下输入各管标记，设定存储数据量
9. 在Global sheet 中画图。
10. 上样，将样本放置好，在Acquisition Dashboard 中点击Load,

a. 阴性细胞调电压，在FSC/SSC 散点图上，调节FSC/ SSC 电压，调节Threshold，找主体细胞群；再调节各荧光通道的PMT 电压，使得阴性细胞的自发荧光在阴性位置，调整十字设门界限。
b. 单阳标记细胞调补偿，在Cytometer 窗口的Compensation 界面下，将Enable compensation 点选上，然后调节补偿至单阳性细胞的平均荧光强度Mean 与阴性细胞的平均荧光强度Mean 值基本一致即为补偿成功
c. 上样本，在Acquisition Dashboard 中点击Record data，即开始收集数据，获取完毕后，点击Unload 即可卸载样本，可进行下一个样本分析。

11. 数据全部收集分析完后，可在Worksheet 窗口的工具栏中点选PDF 的图标即可将数据导出PDF 文件。
关机

• 可先关掉激光,使用cytometer 菜单下cleaning modes 中sample line backflush 功能冲洗2 分钟 。先用稀释的naclo 溶液上样，高速5min 再用di water 10min
  
• 在waste drawer 两边倒入DI water，保证不会堵塞
  
• 关闭液流 换成closed loop nozzle
  
• 放上di water cytometer-cleaning modes-clean flow cell 等待完成并重复一次。
  
• 关软件
  
• 关机 关电脑
  

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