测序仪和PCR仪有什么不同？

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测序仪和PCR仪是现代分子生物学实验中重要的实验室仪器，它们在基因研究和核酸检测等领域发挥着重要作用。虽然两者都与 DNA相关，但它们的功能和原理却大相径庭。测序仪和PCR仪有什么不同？
一、工作原理
1. PCR仪（聚合酶链式反应仪）工作原理
PCR仪的主要功能是进行聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR），这是一种在体外模拟DNA自然复制的过程。PCR仪通过控制温度变化，使DNA样本在以下几个阶段循环：
（1）变性：将双链DNA加热至94-98℃，使DNA双链分离成单链。
（2）退火：将温度降至50-65℃，使引物与单链DNA模板结合。
（3）延伸：将温度升至72℃，DNA聚合酶开始沿着引物方向合成新的DNA链。
通过这三个阶段的循环，PCR仪可以在短时间内实现DNA的指数级扩增。
2. 测序仪工作原理
目前常用的测序技术是Sanger测序和二代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）。



测序仪原理

Sanger测序（第一代测序技术）

• Sanger测序是一种链终止法，其基本原理如下：
  
• DNA模板准备：先需要将待测序的DNA片段克隆到适当的载体中，并通过PCR扩增出大量的单链DNA模板。
  
• 测序反应混合物的制备：将DNA模板与四种不同的脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、适量的DNA聚合酶和一种或多种带有不同荧光标记的链终止核苷酸（ddNTPs）混合。
  
• 链延伸与终止：在DNA聚合酶的作用下，DNA链会不断地延伸。当链终止核苷酸（ddNTPs）被加入到正在延伸的DNA链中时，由于它没有3’羟基，无法形成磷酸二酯键，导致DNA链的延伸在此处终止。
  
• 电泳分离：将测序反应产物加载到毛细管电泳仪中，通过电泳根据片段长度进行分离。由于链终止核苷酸带有不同的荧光标记，因此在电泳过程中会发出不同颜色的荧光。
  
• 荧光检测与数据分析：电泳过程中，荧光检测器会记录下荧光信号，并生成测序峰图。通过分析峰图，可以确定DNA序列。
  

二代测序原理

二代测序（NGS）
二代测序技术包括多种不同的平台，如Illumina/Solexa、Roche/454、Ion Torrent等，它们的工作原理各有不同，但基本步骤相似。以下以Illumina/Solexa平台为例解释其工作原理：

• 文库构建：将待测序的DNA或RNA片段化，并在片段两端添加特定的适配器（ adapters ），通过 PCR 扩增形成测序文库。
  
• 测序芯片加载：将测序文库加载到测序芯片上，每个芯片上有数百万到数十亿个独立的测序反应微孔。
  
• 桥式PCR扩增：在微孔中，通过桥式PCR扩增，使每个微孔中只含有一个特定的 DNA片段的多个拷贝。
  
• 测序循环：测序循环包括以下几个步骤：
  
• 加碱基：向微孔中加入四种不同的荧光标记的核苷酸，但它们不含有链终止基团。
  
• 成像：检测并记录每个微孔中的荧光信号，对应于加入的核苷酸。
  
• 化学降解：去除未结合的核苷酸和荧光标记，为下一轮测序循环做准备。
  
• 数据分析：通过分析每个循环的荧光信号，生成原始测序数据。然后，通过生物信息学分析，将这些数据转换成DNA序列。
  
• 二代测序技术因其高通量、高效率、低成本的特点，在基因组学、转录组学、表观遗传学等领域得到了广泛应用。
  

测序仪

二、PCR仪和测序仪的应用领域
1. PCR仪
PCR仪广泛应用于以下领域：
（1）基因克隆：通过PCR扩增目的基因片段，用于后续的基因克隆、突变等实验。
（2）核酸检测：用于病原体检测、遗传病诊断、法医学鉴定等。
（3）基因表达分析：通过实时荧光定量PCR（qPCR）技术，研究基因表达水平。
2. 测序仪
测序仪应用于以下领域：
（1）基因组学研究：如人类基因组计划、动植物基因组测序等。
（2）疾病研究：通过全外显子组测序、全基因组测序等技术，研究遗传性疾病、肿瘤等疾病的发病机制。
（3）微生物研究：对微生物群落进行多样性分析，揭示微生物与环境的相互关系。




荧光定量PCR仪

PCR仪和测序仪虽然都与DNA相关，但它们的工作原理和应用领域有很大差异。简而言之，PCR仪主要用于DNA的扩增，而测序仪则用于测定DNA序列。
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