免疫荧光分析误区，别踩雷了！

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最近，陆陆续续有多个粉丝朋友在微信后台咨询关于“免疫荧光”的问题，基本都是在问免疫荧光分析的问题。




问题来了。

“ 免疫荧光到底该不该分析？”

关于这个话题，我想细致地采用一问一答的方式进行讨论。这样，读到这篇文章的人不会产生混乱的感觉。
<hr/>问题1：什么是半定量分析？
答：对于一些指标，我们无法检测其绝对的含量，只能通过设置参照指标，以参照指标的倍数来反映目标物相对含量，这个“相对”是针对参照的。分析结果是半定量的，也是没有单位的，因为它本质上是一个比值（目标/参照）。

因此，参照指标的含量在任何情况下是恒定的，否则就是刻舟求剑。这句话的含义可以再延伸一下，即只要在被测物中存在一个恒定已知量，就可以采用它作为参考进行半定量分析。

问题2：举例说明哪些指标是典型的半定量分析？
答：① Western Blot、ELISA、RT-PCR实验，经常采用GAPDH、β-actin等管家蛋白作为内参照，进而分析蛋白的相对表达量。

② 免疫组织化学染色（DAB法）、免疫细胞化学染色（DAB法）。同样也是采用GAPDH、β-actin等管家蛋白作为参照，通过在明场下采集图像，进而使用Image J或Image Pro Plus对阳性表达产物的平均光密度进行半定量分析。




注意上面标红的文字。DAB染色法是在明场，即光镜下进行观察，全程不涉及荧光激发过程。DAB染色后的切片基本不会褪色。也就是说DAB染色后的切片观察不会受到时间、地点、观察者变化等影响，其阳性表达的强度和范围在封片之后是不变的。这是DAB法染色后能够进行半定量分析的根本原因。


问题3：蛋白免疫荧光适合半定量分析吗？
答：不适合。免疫荧光染色的关键是荧光二抗，之后在荧光场下进行拍照，留取照片。表面上看，这个过程与DAB染色后类似，但实际上其中存在相当多的变量，正是这些变量导致免疫荧光染色不适合做半定量分析。

变量①：荧光二抗的质量好坏决定了荧光染色效果。同样一张切片、细胞爬片，采用国产荧光二抗和进口荧光二抗，效果上存在非常大的差异，用过的都知道。此时，我们难道就能仅仅凭借荧光强度和分布范围就说蛋白表达水平不同吗？显然不行。

变量②：荧光拍摄条件。拍摄环境、显微镜品牌和激发荧光决定了镜下观察的效果。同样的操作方法和切片，在不同品牌显微镜下显示出不同的荧光强度。但事实上，切片上的蛋白从未变化，改变的是拍摄条件。

变量③：荧光衰减。荧光衰减是非常明显的。同样的一组切片，1小时内拍摄和8小时后拍摄，荧光效果显然不同。再举个例子，50张荧光染色切片，分析第1张和分析到第50张时，荧光强度已经发生了变化。尽管现在有商用的防荧光衰减试剂，但这些试剂仅能荧光染色在自然环境下不会快速衰减。荧光染色后在激发光的直接作用下，10秒左右就会快速衰减。拍过照的朋友应该有印象，激发光照射在组织切片上后会很快形成一个荧光暗淡的圆形区域，这个区域就是荧光衰减后的表现。
变量④：γ值（伽马值）。有一些情况下，初学者经常犯错误，即拍摄是在不同的伽马值下采集荧光照片，或通过调整伽马值γ来呈现不同的荧光强度。如此操作，就算是同一张荧光染色照片上的荧光强度在γ值=0.75和γ值=0.8时也会被调成为截然不同的效果。在检测微量蛋白时，这种改变会对结论造成根本性的颠覆。因此，所有荧光照片应该在同一γ值下进行分析。



变量⑤：测量指标。假如，我是说假如你真的想对荧光染色做半定量分析，那你该选用哪个指标进行分析呢？荧光染色面积？显然不行。唯一在理论上稍有可能的方法就是将荧光染色彩色图像转换为黑白的灰度图，然后再以灰度值作为测量指标。但是，这个方法依然没有绕开前面提到的那些变量，其分析结果还是不可信的。
变量这么多，你还敢对免疫荧光染色进行半定量分析吗？


问题4：为什么WB蛋白条带可以半定量分析，而蛋白免疫荧光却不行呢？
答：在理论上，得到一张蛋白条带所涉及的操作是相同的，后面对蛋白进行发光和拍照，这些也是在同一时刻进行的操作。不涉及时间差的问题。即你是在同一条件、同一时间对此条带上的不同孔进行检测。尽管也存在信号衰减的问题，但是此时所有孔代表蛋白的荧光衰减程度是一致的。

荧光染色就不一样了，它的图像采集时间更长，且你不可能同时对拍摄所有的切片。这就带来了非常明显的时间差问题，也就放大了荧光衰减对结果的影响。


问题5：为什么TUNEL荧光染色又可以进行分析呢？
答：TUNEL荧光染色后分析是检测细胞凋亡的金标准，是通过将发光物连接到断裂DNA的3‘ 断端上，它不是一个绝对的免疫反应过程。TUNEL荧光染色分析的本质是一个计数问题，即通过计数凋亡细胞核的数量，来分析该张组织切片或细胞爬片上的凋亡指数。这个过程，我们的计数不会受到荧光衰减的强烈影响。只要判断出荧光信号确实属于凋亡细胞核，不管其信号点的大小如何，只要存在信号，我们就可以计数为1个凋亡核。




但是免疫荧光就完全不一样了。蛋白的表达水平直接通过荧光信号的强弱和分布范围来体现。一旦信号衰减，阳性物的荧光就会衰减，分布面积会减小。此时我们无法再评价蛋白的表达水平了。


问题6：既然免疫荧光不适合做半定量分析，那么它到底有什么作用呢？
答：免疫荧光本质上最适合作为定位分析指标。我们可以通过不同的荧光二抗，在不同的激发光下，在同一张切片上的merge出不同染色效果。借此，我们可以对研究的蛋白分布范围、空间相互关系进行评价。这对于研究细胞内超微结构或者是蛋白受体等十分重要。常规的DAB染色根本无法满足要求。




问题7：研究蛋白时，如何最大化证据强度？
答：

①PCR检测蛋白所对应的基因表达水平；

②Western Blot作为主要的蛋白半定量分析方法；

③采用免疫组织化学染色或免疫细胞化学染色（DAB法）进一步对蛋白表达的位置（胞外、胞膜、胞质、胞核）进行评价，通过采用半定量分析法分析蛋白表达水平，巩固Western Blot半定量分析的结果；

④采用免疫荧光的方法，对目标蛋白的空间分布进行再评估，以巩固免疫化学染色时对蛋白空间分布的评估，同时能丰富整个研究的色彩；

⑤有必要的话，可进一步采用以上四种方法研究目标蛋白的受体，搞清楚其上下游和同水平的调控关系。

Ending

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