超微量核酸蛋白测定仪-Nanodrop vs. Qubit

营养师

凡是需要做分子生物学实验的lab，肯定逃不了要买一台核酸定量的机器。目前最为流行的仪器是Nanodrop，只需滴加一两微升的样品，按一下按钮，利用核酸的紫外吸收特性，即可得到浓度数据。近几年，以Qubit为代表的基于特异荧光染料法的仪器也逐渐进入科研人员的视野。那么，这两类仪器有什么区别，在使用时需要注意什么，如何根据实验室需求来选购？如下文所示。
（注：以安捷伦公司为代表的毛细管电泳法不在本文的讨论范围内。）
首先我们需要来理解两台仪器在核酸定量原理上的区别。正如方才所言，Nanodrop利用了核酸的紫外吸收特性。


图1.Nanodrop全家福
核酸，包括DNA和RNA，均由核糖、磷酸基以及碱基构成。其中，由于碱基含有芳香环结构，因此具有紫外吸收的特性。核酸的特征吸收波长为260 nm。根据朗伯比尔定律，已知物质的消光系数（几十年前早已测量），液层的厚度（固定的样品室），就能利用其吸光度来计算出物质的浓度。与此同时，还能通过计算A260/A280和A260/A230的数值，估计核酸的纯度。（280 nm吸光通常来自蛋白质，而230 nm则通常来自糖类和苯酚等。）
而Qubit这一类仪器采用的是荧光染料法。这些荧光染料可以特异地与不同种类的核酸链相结合，并在特定波长光源的激发下，发出荧光。其中，结合了核酸的荧光染料，相比那些游离的，信号可增幅数十倍至数百倍，因此可以和背景区分开来。目前，做测序的实验室基本把Qubit当标配仪器了。


图2.Qubit 3.0及配套试剂
虽然以Nanodrop为代表的紫外吸收法在科研领域已经沿用了数十年，但由于原理上的限制，这一类仪器有无法避免的缺陷。
1、紫外吸收法无法区分DNA和RNA
这一点其实在原理上就很好理解了。如下图所示，具有紫外吸收的结构是核酸的碱基，而DNA和RNA均含有碱基，因此当一份样品同时含有DNA和RNA的时候，无论你本意是想测哪一个，均会高估其真实浓度。


图3.核酸的结构
而Qubit的荧光染料法则避免了这个问题。只要采用DNA、RNA特异的染料，就能有选择性地测定样品中的核酸浓度。下图是Qubit的官方测试数据。这个实验是在DNA样品中混合入不同比例的RNA，并用Qubit法和紫外吸收法分别进行测定。当DNA的样品足够纯时（DNA：RNA = 10：0），两种方法测得的数值并没有显著区别。但当混入的RNA越来越多，紫外吸收的数值也跟着升高（蓝色和绿色柱子），而使用双链DNA染料的Qubit数值则没有改变（红色柱子）。使用RNA染料用Qubit进行测定，则会发现，随着RNA混入的增加，读数也跟着升高。


图4.Qubit和紫外吸收法对DNA-RNA混合样品的测定
目前，双链和单链DNA、RNA及蛋白质均有特异的荧光染料。也就是说，无需专门纯化样品，或者在未知污染程度的情况下，使用Qubit可以方便地得知浓度信息。
2、紫外吸收法的定量限较高
对于任何仪器分析，都具备其检出限和定量限。Nanodrop标称的检出限是2 ng/µl（双链DNA），然而定量限则远高于此。其他的Nanodrop用户也有类似的体验，曾经在ResearchGate上看到说，低于50 ng/µl的话就容易测不准，变异度会增大。以下同样是来自Qubit的官方数据。当DNA的浓度低于某个程度时，紫外吸收法的偏差和变异度就突破天际了。




图5.Qubit与紫外吸收法测定低浓度DNA时的偏差及变异度比较
这两张图中，紫外吸收法得到的偏差和变异度在我看来已经算小的了，要低于4 ng/µl双链DNA才会出现问题。然而在实际使用中，低于10甚至20 ng/µl时就比较容易出乱子。而PCR产物胶回收等应用，最终的实际浓度往往就落在这个容易测不准的范围内。
3、紫外吸收法对溶液的pH和盐浓度敏感
在研究物质吸光度时，我们总要明确地定义缓冲液的离子强度以及pH，这就说明，吸光度本身是受到这两个因素影响的。
通常而言，偏酸的溶液，容易给出偏低的A260/A280数值。相反，偏碱的溶液则容易高估。相应地，也有报道称，当用水作为溶剂时，紫外吸收测定的数值变异度增大，而当使用Tris或Tris-EDTA溶液进行测定时，重复性就提高了。这其中的原因，很可能是空气中溶解入水中的CO2浓度差异造成的。离子强度对于紫外吸收的影响比较复杂，这里不展开。
相比之下，荧光染料法对样品的污染和pH等的容忍度较大。
4、紫外吸收法对降解比较严重的核酸无能为力
这一点，同样也是由紫外吸收原理的局限性所决定的。紫外吸收测定的对象是碱基，因此无论核酸是完整成链的，还是降解成单个游离核苷酸，该方法均无法加以区分。尽管我们可以通过A260/A280数值是否过大来估计核酸样品的降解状况，但却无法选择性地只测定那些结构完整的核酸的浓度。
而荧光染料通常结合的是核酸的链结构，并不会与游离的单核苷酸相互作用。不过话说回来，对于那些尚未降解成单个核苷酸而呈短链状态的核酸，荧光染料法是无法将其与完整核酸区分开来的。
结语
但是，紫外吸收法也不是一味的烂，荧光染料法也不是说全方位吊打（大面积吊打还是做得到）。
如果在实验中获得的核酸样品总是很纯净且均一（如原材料是容易对付的培养细胞，还用品质好的试剂盒进行抽提；而非奇奇怪怪的极端样品，还要是自己配的试剂），同时产量又很高，那紫外吸收法完全可以胜任，外加测定速度秒杀荧光染料法。此外，荧光染料法对温度比较敏感，比如上一回是在25℃室温制作并储存的标准曲线，而这一回要测定样品时实验室空调坏掉，一下子有了3℃以上的温差，那么标曲就得重新制作。同时，荧光染料要现用现配，样品至少要染2 min，花费的时间比紫外吸收法要长。
以下用一张表总结两者的优劣。请根据自己的实际情况斟酌。



原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/151282802