PCR实验常见问题及对策

笑看风云

问题1：阳性对照有条带，而样本无结果
原因：①模板含有抑制物，含量低；②Buffer 对样品不合适；③引物设计不当或者发生降解；④反应条件：退火温度太高，延伸时间太短。
对策：①纯化模板或者使用试剂盒提取模板 DNA 或加大模板的用量；②更换 Buffer 或调整浓度；③重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者更换一管新引物；④降低退火温度、延长延伸时间。
问题2：非特异性扩增
原因：①引物特异性差；②模板或引物浓度过高；③酶量过多；④Mg2+浓度偏高。
对策：①重新设计引物或者使用巢式 PCR；②适当降低模板或引物浓度；③适当减少酶量；④降低 Mg2+浓度，或更换 mix。
问题3：GC-rich（正常范围为40-60%，>60%为GC-rich）区域难以扩增
原因：GC-rich 区域需要更高的温度才能打开双链，常规的变性温度下可能解链不完全; 同时由于单链的 G+C 丰富区易于自身互补配对形成稳定的发夹二级结构而使 PCR 引物难以结合到模板上，DNA 聚合酶也难以延伸或延伸停止，结果出现严重的非特异性条带，甚至扩增不出靶基因。
对策：①提高预变性温度或变性时间，使双链完全打开；②TD-PCR（梯度 PCR ）；③换用热启动酶或 mix；④增加 DMSO 等共溶剂，协助 DNA 变性，降低引物 Tm 值，提高产物扩增特异性。
问题4：产物在凝胶上呈 Smear 状态
原因：①模板不纯；②Buffer不合适；③退火温度偏低；④酶量过多；⑤dNTPs、Mg2+ 浓度偏高。
对策：①纯化模板；②更换 Buffer 或 mix；③适当提高退火温度；④按浓度比例设置酶的添加量；⑤适当降低 dNTPs 和 Mg2+ 浓度；⑥减少反应循环次数。
问题5：空白对照出现目的扩增产物
原因：靶序列或扩增产物的交叉污染。
对策：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用；③各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。


四、结语
PCR、qPCR、RT-PCR和RT-qPCR这四种技术都是基于聚合酶链式反应（PCR）的技术，但是它们之间存在一些区别。
1.PCR：聚合酶链式反应（PCR）是一种体外扩增DNA分子的技术，利用DNA聚合酶和多个引物在所需温度下扩增目标DNA分子。PCR反应分为三个阶段：预变性、变性-退火-延伸和延伸。PCR技术主要用于DNA序列的扩增和检测，应用广泛，如基因克隆、DNA序列测定等。
2.qPCR：实时定量聚合酶链式反应（qPCR）是一种实时检测PCR过程中荧光信号变化的技术，可以定量检测目标分子的含量。qPCR通过在反应体系中加入荧光探针或荧光染料，在PCR过程中实时监测荧光信号的变化，从而计算出目标分子的拷贝数。qPCR技术主要用于DNA或cDNA的定量分析，如基因表达分析、病毒载量检测等。
3.RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是一种把RNA分子转录为cDNA后，在体外进行DNA扩增的技术。RT-PCR技术结合了反转录和PCR两个步骤，主要用于RNA分子的扩增和检测，如基因转录水平分析、miRNA表达研究等。
4.RT-qPCR：逆转录实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）是一种结合了逆转录PCR和实时定量PCR的技术，可以对RNA分子进行定量分析。RT-qPCR先通过反转录酶将RNA逆转录成cDNA，然后利用qPCR技术对cDNA进行定量分析。RT-qPCR技术广泛应用于RNA表达水平的研究，如基因表达分析、病毒载量检测等。
总之，PCR、qPCR、RT-PCR和RT-qPCR这四种技术的主要区别在于它们的应用领域和检测目标不同。PCR主要用于DNA序列的扩增和检测；qPCR可以实时定量检测DNA或cDNA的含量；RT-PCR主要用于RNA分子的扩增和检测；而RT-qPCR则结合了RT-PCR和qPCR的技术，可以对RNA分子进行定量分析。


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