分子实验学习日记（三）——PCR实验

临床医师

来源：知乎
一、基本原理
PCR技术的基本原理类似于的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则进行半保留复制，复制成同样的两分子拷贝。
（1）变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程，高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）；
（2）退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子，低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）；
（3）延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链，中温延伸，DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）；
以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。


图源:Khan Academy


图源:Enzoklop [CC BY-SA 3.0]
二、实验步骤
1、反应体系的建立：以2.5 U/μl Taq DNAPolymerase 50 μl反应体系如下(可根据比例放大或缩小反应体系)
为了便于实验的效率，将ddH2O、10 xTaq Buffer、dNTP Mixture、DNA Polymerase混合成Mix，再在Mix中加入Primer 1\2与Template。


图源:Taq DNA Polymerase(ET101)
2、进行PCR反应循环
（1）94℃ 3min
（2）94℃ 3sec
（3）55℃ 3sec
（4）72℃ 1min
（5）72℃ 5min
由于原本已有一个循环，（2）-（4）步设置29个循环。
3、结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
三、实验原理



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