分子生物学实验之PCR

风云

来源：知乎
分子生物学实验之PCR


DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP就可以完成特定基因的体外复制。


                                                                       PCR
                                                    (Polymerase Chain Reaction)
聚合酶链反应简称PCR，是以DNA半保留复制机制为基础，发展出的体外酶促合成、扩增特定核酸片段的一种方法。PCR最大的特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
                                                             DNA复制的所需条件
1、模板和底物
DNA复制是模板依赖性的，必须以亲代DNA链作为模板，亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。同时，DNA复制需要以四种脱氧核糖核苷酸，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，为底物合成子代DNA。
在体外进行DNA复制时，模板和底物均可通过人工添加解决。
2、引物
DNA聚合酶必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物，才能开始合成子代DNA链。在体外进行DNA复制时，可以人工合成具有特定序列的寡核苷酸作为引物，该引物序列与进行扩增的目的核酸片段互补匹配，从而开始目的片段的扩增。
3、模板双链的解旋
在DNA的半保留复制机制中，双链DNA的解旋是在拓扑异构酶和解链酶的作用下完成的，该过程需要拓扑异构酶识别DNA的复制起点才能开启，而体外扩增特定的核酸片段只需要特异性的复制目的核酸片段，因而需要一种方式使得模板DNA解旋为单链DNA，之后在使之与引物结合，从而特异性的扩增目的核酸片段。
4、DNA的变性
DNA变性是指核酸双螺旋结构中碱基对的氢键断裂，使得双链变为单链的过程。
5、DNA的复性
加热变性的DNA在缓慢冷却后可以由单链恢复为双链结构，这一过程称为DNA的复性，也称为“退火”。当温度降低至比变性DNA的Tm低25℃时，其复性效果最佳，越远离此温度，复性效果越差。因此，可以利用此特性，在加热使模板DNA变性后，将温度降低至特定温度，从而使所加引物与模板DNA复性结合，进而能够对引物所规定的核酸片段进行特异性的扩增。
6、DNA聚合酶
为了使模板中特定的核酸片段进行扩增，在模板与引物结合后，需要有DNA聚合酶的参与，但是由于DNA变性和复性过程的温度较高，普通的DNA聚合酶在此过程中会由于温度过高而失活。科学家为了解决该问题，从水生栖热菌 (Thermus Aquaticus) 中分离出了具有热稳定性的DNA聚合酶，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活。


PCR技术的原理
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于靶序列连段互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
1、PCR反应体系：
10x扩增缓冲液；
4种dNTP混合物（终浓度）；
引物（终浓度）；
模板DNA；
Taq DNA聚合酶；
Mg2+；
补加双蒸水。

2、PCR引物设计
PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
（1）引物设计的基本原则
a.引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
b.引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
c.引物内部不应出现互补序列。
d.两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。
e.引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
f.引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。
g.引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。
（2）引物设计软件
a.Primer Premier5.0 （自动搜索）
b.vOligo6 （引物评价）
c.vVector NTI Suit
d.vDNAsis
e.vOmiga
f.vDNAstar
g.vPrimer3 （在线服务）
3、PCR反应条件
（1）预变性：
95℃，5～10min；
（2）按如下过程，进行30次循环“变性-退火-延伸”的PCR反应：
a.变性：95℃，10～30s；
b.引物退火：引物特定退火温度，30s；
c.引物延伸：72℃，1min。
（3）PCR反应的最后延伸和终止
在最后一次反应循环结束后，应使PCR反应在72℃进一步延伸5～10min，使得未完全延伸的扩增片段全部延伸完全，以提高产物的扩增效率；然后，将反应混合物冷却到4℃，或加入10mmol/L的EDTA终止反应。


                                                                逆转录PCR
PCR反应需要以双链DNA作为模板，因此最初的PCR反应用于检测目标样本的基因组中是否存在特定的目的片段，但是这种以基因组DNA为模板的PCR反应无法检测目的基因是否在样本中表达，此外由于真核生物的基因中存在内含子，直接通过基因组DNA进行PCR也很难确定样本中是否存在目的基因，针对这一问题，发展出了逆转录PCR的技术。
1、技术原理：逆转录PCR (reverse transcription PCR，RT-PCR)是以mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA，之后再进行PCR的过程。
2、反应过程：mRNA逆转录合成cDNA的过程分为两步：
在特定引物的介导下，通过逆转录酶的催化下以mRNA为模版合成互补的cDNA第一链；升高温度使cDNA第一链与mRNA解离，然后降温，使其与另一引物退火结合，并由DNA聚合酶催化延伸生成cDNA第二链。
3、逆转录反应体系
（1）RNA模板：通常20μL的逆转录体系，加入总RNA 1μg，如果总RNA加入过多，会导致逆转录不充分。
（2）引物：常用的有随机引物和Oligo(dT)引物：随机引物会将所有RNA分子均进行逆转录，此时得到的cDNA大部分来源于rRNA，主要在部分mRNA含有逆转录酶终止序列而难以得到其全序列时使用；Oligo(dT)与真核生物mRNA的Poly(A)区域匹配，可以特异性的对mRNA进行逆转录。
（3）逆转录酶：逆转录过程涉及以RNA为模板合成DNA和以DNA为模板合成互补链的两个过程，目前市场上的逆转录酶都同时具有这些功能，因此只需在反应体系中加入逆转录酶即可，而不需额外加入DNA聚合酶。
（4）4种dNTPs
https://mp.weixin.qq.com/s/8chvAefJw2nx2LxhrqtQ-A

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