PCR实验注意事项

HaHa

PCR全称聚合酶链式反应，是一种用于特异性扩增DNA片段的分子生物学技术，在体外进行DNA的增量。
PCR的反应过程分为预变性--变性--退火--延伸--完全延伸。总体原理简单来讲就是使模板DNA在高温下解开双螺旋结构，然后和设计的特异性引物碱基对应结合，然后进行体外DNA复制。
PCR试验的试剂组分有ddH2O、引物、DNA模板、商业化的预混DNA酶。在进行PCR操作时，需要先进行整体体系液的混合，根据你需要扩增的片段设计引物，准备好对应的DNA模板。市面上DNA聚合酶有有多种，有高保真的提高复制效益的，也有物美价廉的Taq聚合酶，不同公司的产品性能也会不一样，它们最终组分的体系，PCR过程中的时间和温度也都有差别。
引物对整个PCR实验也非常重要，在设计引物时需要注意几个点，一是引物长度，通常把PCR引物长度保持到20个碱基的长度左右。二是注意设计的引物的Tm值，上下游引物Tm值要相似，保持在55℃左右。三是注意GC的比例，保持引物GC含量在40-60%。
PCR结果常见问题
1，条带消失或过淡。条带消失的情况需要先观察阳性对照的条带，如果阳性对照也没有条带，则怀疑是PCR程序或者酶的问题，可能是程序设置的温度或者时间不对，也有可能是酶失活了导致反应没有进行。如果阳性有条带，目的组无条带，则怀疑引物的问题，可能是引物特异性不高，或者Tm值不正确。条带过淡则可能是因为程序的问题，温度和时间不合适都有可能使PCR反应产物产生过少，调整至合适的程序能有效提高效率，DNA模板的量过少或者体系中DNA抑制剂的污染也会导致条带过淡现象的产生。
2，条带拖尾或出现“微笑”条带。这一类情况一般是因为凝胶浓度不合适，DNA在凝胶上移动出现阻滞情况。或者电泳环境温度过高了，导致凝胶出现融化。还有一种可能的情况是琼脂糖凝胶在制备的时候没有完全融化导致琼脂糖不匀。
3，出现杂带。如果阴性对照和阳性对照也出现了同样的杂带，则是体系中有成分被污染了，或者是枪头，工作台，PCR管这方面的外部成分污染。只有扩增的产物出现杂带就有可能是以下情况：①引物特异性不高，同时扩增了模板的其他部分；②酶不够好，换用高保真酶或者其他品牌的酶进行尝试；③引物自联系数过高出现了引物二聚体，需要重新设计引物；④DNA模板污染
4，条带大小不正确，这一情况可能是引物设计错误，或者模板选择有误，也有可能是体系污染的原因。
以上是一些基本的PCR产物凝胶电泳会出现的问题，当然还有许多别的情况，和别的原因。这里可能有遗漏。大家也可以在评论区补充和交流。