Trizol法提取RNA必须了解的基本原理

生物科研实验室

Trziol的作用是裂解细胞。

但这个答案并不全对，Trizol有两个作用：

① 裂解细胞：Trizol的主要成分是苯酚，使蛋白变性。异硫氰酸胍可以裂解细胞，使核蛋白复合体中的蛋白变性，释放出核酸。

② 抑制RNA酶：苯酚不能完全抑制RNA酶的活性，Trizol中还存在8-羟基喹啉、异硫氰酸胍和β-巯基乙醇等，抑制RNA酶。
RNA提取实验实验过程中所需要知道的实验原理

1. RNA的特性
1）单链，不稳定；
2）碱性条件下易水解，在偏酸性条件下稳定；
3）RNase降解RNA，生物体内部和外部环境中存在大量的RNase,并且RNase不易失活，高温下仍能正确折叠恢复活性。
2. 你的组织样特性
了解样品的性质、核酸含量、酶含量和特殊杂质含量等。例如由于骨组织坚硬，骨细胞密度低，且含有大量蛋白多糖难以与RNA分离，因此骨组织不适合使用Trizol法提取。常见的植物如番茄、葡萄、土豆、棉花等，都含有大量的多糖或多酚，影响RNA的得率和质量。鸟血液中核细胞的含量是人的1000倍，用人血一样的起始量去抽提鸟血的核酸，怎么可能成功？失败了又怎么知道原因所在？
因此需要根据组织不同调整RNA提取方案。
3. Trizol的成分和特性

1）成分：苯酚，异硫氰酸胍，8-羟基喹啉和β-巯基乙醇；
2）PH为4.2左右；低pH值的酚使RNA进入水相；当PH接近中性时，DNA会进入水相。  也解释了说明书上的：①为什么要推荐使用量，组织样品加的不是越多越好？②为什么会有DNA污染？
4. 氯仿的特性和作用
1) 分相：氯仿可以有效地使有机相和无机相迅速分离。加入氯仿，离心后，样品即分成水样层(RNA存在于水样层)、中间层(DNA和蛋白质存在于中间层)和有机层；

2）除去苯酚：苯酚微溶于水，水相里可能有痕量的酚，容易损伤RNA，氯仿可以萃取苯酚；

3）变性蛋白和抑制RNase活性；

4）除杂：除去一些脂溶性杂质(比如油脂、脂溶性色素等)。

5. 异丙醇的特性和作用
1）沉淀RNA：疏水能力强，能夺取RNA周围的水分而使RNA聚集沉淀；

2）也会沉淀杂质：蛋白和盐等会被沉淀；

3）挥发慢：因此还需要乙醇清洗。

6. 75％乙醇的特性和作用

1）洗涤异丙醇和氯仿等残留

2）清洗蛋白

3）清洗小分子：例如盐，这些小分子在较低浓度的乙醇中更易溶解；

4）易挥发

5）保持RNA沉淀：在75％浓度下不会溶解

7. 溶解和保存

谨记，每一步的实验步骤都不能完全达到想要的效果，因此必须每一步都要考虑注意事项。

使用DEPC水，放置-80℃冰箱，最好提取完就使用，就是每一步都要防止RNase。

8. 质量检测

见: RNA提取和质量检测的常见问题和解决步骤

基于这些理论知识，你就可以自主思考并回答一些实验小问题，例如：

我提的RNA为什么那么多杂质，哪一步出问题了？

我的RNA被DNA污染了，怎么回事？

为什么我RNA提不出来？

RNA降解很严重，是什么原因？

当然，经验也很重要，多看多学多思考，知识进入你大脑。