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[讨论] 同时检测牛奶中喹诺酮类和庆大霉素残留的胶体金免疫层析方法研究

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发表于 2019-12-16 09:33 | 显示全部楼层 |阅读模式

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【研究意义】喹诺酮类(quinolonesQNS)和庆大霉素(gentamicinGEN)均为广谱、高效抗菌药物,对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的作用,因此是猪、鸡、鱼、虾等动物养殖中常用的兽药品种,也常作为药物添加剂添加到饲料中促进动物的生长发育[1-2]。随着这两类药物在畜牧养殖业的不断应用,其残留问题日趋严重,在动物性食品中的残留不仅危害人的身体健康,如QNS可引起恶心,呕吐,影响软骨发育,GEN具有耳毒性和肾毒性,还污染环境、影响新药开发和临床用药,而且不利于养殖业的健康发展及畜禽产品的出口;更为严重的是,这两类药物为人畜共用药物,动物性食品中残留较低浓度的药物容易诱导人类致病菌产生耐药性。为严格控制这两类抗生素在动物源食品中的残留,保证人民身体健康,保证进出口产品质量,提高中国畜产品的国际信誉,中国农业部第235号公告对这两类药物在动物源性食品中的最高残留限量均作了明确规定[3]。因此,研究这两类药物的残留检测方法对中国的食品安全监测具有非常重要的意义。【前人研究进展】目前,国内外用于动物源性食品中QNSGEN残留检测的分析方法主要有微生物法[4]、放射化学法[5]、免疫分析法[6-10](包括放射免疫法、酶联免疫法、荧光免疫法、免疫传感器和蛋白芯片)、薄层色谱法[11]、毛细管电泳色谱法[12-13]、高效液相色谱法[14-16]、气相色谱-质谱法[17]、液相色谱-质谱法[18-20]等。微生物方法所需设备简单、价格低廉,适合于大批样品的检测;但是该法存在菌种不易筛选,影响因素复杂、检测耗时长、稳定性差、精确度和灵敏度低的特点,往往不能满足目前实际检测工作的要求。高效液相色谱、质谱联用等方法灵敏度高,可以提供定量及确证分析,但是前处理复杂,需要昂贵的仪器,且对操作人员有专业的要求,不适合基层检测分析。【本研究切入点】免疫分析法是近年来快速发展的一种方法,具有灵敏度高、特异性强、适用范围广、操作简便、快捷、成本低廉及现场适应能力强等优点。胶体金免疫层析法与其他免疫方法如ELISA相比,样品前处理简单,不需要任何仪器,结果可在5—10min内获得,且对操作人员没有专业要求,非常适合现场大批量样本的筛选。但目前国内外还未出现可同时检测QNS和GEN两类药物的胶体金免疫方法的报道。【拟解决的关键问题】建立同时检测牛奶中QNS和GEN两类药物残留的胶体金免疫层析方法。
1材料与方法
本试验于2013年1—7月在中国农业大学国家兽药安全评价中心及北京维德维康生物技术有限公司完成。

1.1 主要试剂和仪器
QNS单抗和抗原、GEN单抗和抗原均由北京维德维康生物技术有限公司制备。GEN、链霉素(streptomycinSTR)、卡那霉素(kanamycinKAN)、新霉素(neomycinNEO)、恩诺沙星(enrofloxacinENR)、环丙沙星(ciprofloxacinCIP)、诺氟沙星(norfloxacinNOR)、氟甲喹(flumequineFLU)、培氟沙星(pefloxacinPEF)、沙拉沙星(sarafloxacinSAR)、二氟沙星(difloxacinDIF),购自中国兽药监察所。氧氟沙星(ofloxacinOFL)、噁喹酸(oxolinicacidOA)、麻保沙星(marbofloxacinMAR),氟罗沙星(fleroxacinFUL)、奥比沙星(orbifloxacinORB)、依诺沙星(enoxacinENO)、达氟沙星(danofloxacinDAN)、洛美沙星(lomefloxacinLOM)、司帕沙星(sparfloxacinSPA)、帕珠沙星(pazufloxacinPAZ)、牛血清蛋白(BovineserumalbuminBSA),氯金酸等均购自美国Sigma公司。硝酸纤维素(nitrocelluloseNC)膜,美国Millipore公司;吸水纸、PVC底板等购自上海金标公司。
恒温磁力搅拌器,德国Heigoph公司;高速冷冻离心机,德国Kendro公司;电子分析天平,Mettler-Toledo仪器公司;微电脑自动斩切机ZQ2000,上海金标公司;B-3060喷膜平台,美国BioDot公司,冷冻干燥机FD-1B-50,北京博医康实验仪器有限公司。
1.2 胶体金的制备
采用柠檬酸三钠还原法制备[21]。取100mL双蒸水加热至沸腾,在持续搅拌的情况下加入1mL1%(w/v)的氯金酸,等水再次沸腾以后,取2mL1%(w/v)的柠檬酸三钠,一次性快速加入锥形瓶中。继续搅拌加热15min,直至溶液呈透亮的红色。室温冷却,用去离子水恢复到原体积,4保存备用。
1.3 金标抗体的制备
本研究采用棋盘法确定抗体标记的最佳pH值和最佳抗体用量。将装有100mL胶体金溶液的洁净小烧杯置于磁力搅拌器上并搅拌,用0.1mol·L-1K2CO3调pH值至8.5,然后逐滴加入10mL用双蒸水稀释的混合抗体,搅拌10min后,加入20%w/vBSA溶液2mL,继续搅拌10min412000r/min离心30min,弃上清,用0.02mol·L-1PBS5%蔗糖,1%BSA0.5%吐温20pH7.4)将管底红色沉淀悬溶至100mL,将悬溶好的金溶液加入到洁净酶标微孔中,每孔加入40μL,然后放入冷冻干燥机中冷冻过夜,将冻好的金标微孔用铝箔袋密封好待用。
1.4 抗原包被液和包被
条件的选择分别采用0.05mol·L-1pH9.6的碳酸盐缓冲液(CarbonatebufferCB)、0.01mol·L-1pH9.0的Tris-HCl缓冲液和0.01mol·L-1pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)作为包被缓冲液,将包被原稀释后用BioDot-3060喷在NC膜上,比较三者检测线颜色深浅及灵敏度;分别将喷有包被原的NC膜置于37干燥2h或37干燥过夜,比较两者检测线颜色深浅及灵敏度。
1.5 检测过程取
200μL新鲜奶样加入微孔金中,轻轻来回吹打3—4次使微孔金完全溶解后,将组装好的试纸条插入微孔中,5min后即可观察结果。检测结果见图1
1.png
1.6 试纸条参数确认
1.6.1 检测限随机抽取120份经国家兽药安全评价中心检测不含QNS和GEN的阴性牛奶样本,抽出100份样本平均分成5组,用ENR和GEN标准品工作液添加5个浓度梯度,分别为5-510-1020-2050-50100-100ng·mL-1,另20份样本做阴性对照。共3个批次,两个重复试验。将T1T2检测线刚好完全消失的浓度定为检测限。
1.6.2 交叉反应分别将上述17种喹诺酮类药物和4种氨基糖苷类药物工作液作系列稀释:即1005020105ng·mL-1,同时设阴性对照,分别用试纸条进行测试。
1.7 盲样检测
为了鉴定试纸条的准确性与可靠性,从国家兽药安全评价中心随机抽取60份奶样,并用胶体金试纸条、《SN/T1751.2—2007进出口动物源食品中喹诺酮类药物残留量检测方法第2部分:液相色谱-质谱/质谱法》和《GB/T21323—2007动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱-质谱/质谱法》对牛奶中QNS和GEN的含量进行检测并比对结果。
2结果
2.1胶体金颗粒选择本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。胶体金颗粒大小与柠檬酸三钠的加入量有关。随着加入的柠檬酸的量增加,胶体金的最大吸收波长下降。但加入的柠檬酸钠的量超过2.5mL,最大吸收波长基本不变。胶体金颗粒大小对试纸条的灵敏度和显色的影响见表1
2.png
由表1可知,加入2mL1%柠檬酸三钠时,试纸条的显色和检测限可达到最佳状态。且该条件下制备的胶体金颗粒均一,粒径适中,因此随后实验均采用该条件下制备的胶体金溶液。
2.2金标抗体最佳pH值和最佳蛋白用量的筛选结果采用方阵法测定的pH值和抗体蛋白用量对试纸条检测限影响的结果见表2
由表2可知,pH值的改变对灵敏度的影响很大,当pH5.5时,抗体不能和胶体金偶联,偶联过程胶体金溶液即分解变色。而当抗体用量降低至5µg·mL-1时,制得的金标抗体不稳定。当pH值在6.5—7.5之间,抗体用量为10—30µg·mL-1,试纸条检测线均显色,但加入50ng·mL-1的标准溶液检测线仍不消失。当pH值在8.5—9.5之间,灵敏度明显上升,检测限均能达到20ng·mL-1。但pH8.5的显色明显强于pH9.0以上。因此,在初步优化的基础上对偶联pH值和抗体用量进行了进一步优化,结果表明,当pH为8.5,抗体用量为10µg·mL-1胶体金时,试纸条检测限和显色均达到最佳状态。
2.3包被液和包被条件的选择
包被液和包被条件对试纸条显色和检测限的影响结果见表3
3.png
结果表明,采用PBS作包被液较之CB和Tris-HCL效果更好,说明盐离子浓度和pH值可影响包被原在NC膜上的吸附效果。喷涂包被原的NC膜37干燥2h或37干燥过夜检测线显色深浅和灵敏度均相当,因此,为节约操作时间,选择37干燥2h的方式进行包被。
2.4试纸条参数的确定
2.4.1检测限确定采用系列浓度添加的奶样进行试纸条的跑样,确定试纸条的检测限。结果见图2
5.png
阴性对照控制线和检测线均显色,当ENR和GEN的添加浓度均为5ng·mL-1时,检测线显色明显变浅,滴加20-20ng·mL-1以上浓度时,T1和T2检测线则完全消失。因此试纸条检测牛奶样本中ENR和GEN的检测限可定为20ng·mL-1
2.4.2交叉反应试验试纸条的交叉反应试验结果见表4
4.png
试纸条对氨基糖苷类的其他3种药物KANNEOSTR无交叉反应。对QNS如CIPNORFLUPEFOFLENOOAMARFULORBDANLOM的交叉反应明显,且对这12种药物的检测限均可定为20ng·mL-1。对其余QNS如SARDIPSPAPAZ均无交叉反应。
2.5盲样检测
随机抽取60份盲样,分别用HPLC-MS/MS与试纸条方法同时进行检测。用HPLC-MS/MS共检测出6个阳性样本。其中,检测10号样本含GEN156ng·mL-117号样本含GEN98ng·mL-126号样本含OFL12.5ng·mL-133号样本含GEN64ng·mL-145号样本含GEN189ng·mL-152号样本含OFL45ng·mL-1,其他样本均为阴性,试纸条的检测结果与HPLC-MS/MS的检测结果完全吻合。结果表明筛选方法可将阳性样本全部检出,且未出现假阳性和假阴性现象。部分盲样的试纸条检测结果见图3
7.png
3讨论
本研究首次报道了胶体金免疫层析方法同时检测牛奶中QNS和GEN的残留。2005年,Jin等[22]报道了牛奶和血浆中GEN残留检测的胶体金免疫方法,2008年,Zhu等[2]报道了鸡肉组织中12种QNS残留检测的胶体金方法。胶体金颗粒与抗体蛋白标记过程中,一般采取一对一的方式,即将单个抗体蛋白与胶体金颗粒进行标记,这种方式既比较容易实现,同时标记的抗体也比较稳定。本研究为了能在一个试纸条上同时检测两类药物,先将单个抗体蛋白与胶体金颗粒进行标记,在确定单个抗体蛋白标记的最佳pH和最佳抗体用量后,先选定一个适合两个抗体蛋白同时标记的pH值,然后将两个抗体蛋白按一定比例混合,这个比例范围可以从91到11进行摸索。在确定两个抗体蛋白的最佳比例用量后,再返回摸索抗体标记的最佳pH值。本研究同时对比了抗体蛋白进行单独标记后再混合在一起的检测效果。结果表明:混合标记比单独标记再混合的金标抗体更加稳定,试纸条显色颜色更加均一和一致。单独标记的金标抗体混合后,显色效果和检测限不一定与单独标记时一致,最主要的问题还是金标抗体不如混合标记稳定,这可能与两个抗体与胶体金颗粒结合的电荷是否平衡有关系。单独标记再混合,可能有一个电荷再平衡的过程,所以导至不稳定。当然这种混合标记的前提必须建立在两个或多个抗体蛋白单独标记时最佳pH相同或接近的情况下,这取决于抗体的特性和效价。这种一个试纸条进行多残留检测的模式,是今后胶体金免疫层析方法发展的趋势。
本试验对试纸条上包被GEN和QNS抗原的位置进行了研究。首先将GEN抗原包被在TI位置,QNS抗原包被在T2位置,然后互换位置进行对比试验。发现显色和抑制没有差异。
为了验证多种抗体蛋白混合标记的稳定性,本研究对冻干金标抗体进行了加速稳定性试验。将冻干金标抗体45烘烤15d后,发现试纸条的显色和抑制情况与450d的结果基本没差异,结果证明了这种混合标记法的可行性。
试验中采用胶体金免疫层析法、HPLC-MS/MS法对牛奶样本进行了检测,结果表明,采用这两种方法,阳性样品全部检出,同时筛选方法未出现假阳性和假阴性现象,说明二者的测定结果基本相符。实际操作过程中,可以采用胶体金免疫层析对样品进行现场快速初筛,筛选的疑似阳性样品,可以采用HPLC-MS/MS方法对样品中QNS和GEN的含量进一步确认。
4结论
本研究成功建立了可同时检测牛奶中13种QNS和GEN残留的胶体金免疫层析方法。试验结果表明该方法对牛奶中13种QNS和GEN的检测限均为20ng·mL-1。牛奶样本直接检测,无需处理,整个检测过程5min内完成。采用该研制的试纸条和理化分析方法对抽检牛奶样本进行对比检测,结果表明,二者的测定结果基本相符,表明该试纸条检测方法准确可靠,适用于现场大批量样本的快速检测和筛选。
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