Taq酶对PCR定量检测结果的影响

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摘要聚合酶链式反应（Polymerase ChainReaction,PCR）是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA 分子扩增 107～108 倍，大大提高了 DNA 的得率。在 PCR 反应过程中，Taq 酶对 PCR定量检测结果起到很大的影响。本文重点探讨 Taq 酶对 PCR 定量检测结果的影响。
P C R 的发展可以说起源于 D N A 合成酶的发现。DNA合成酶最早于1955年发现 (DNA polymerase I),而较具有实验价值及可得性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow所发现，但由于此酶极易被热所破坏，因此不符合一连串的高温连锁反应所需。从基因修复复制 (DNA repair replication)得到启发，Dr. Kjell Kleppe于1971年首次发表了第一篇 PCR 反应的实验论文，提出了 PCR的原始雏形概念。但由于当时受所使用的DNA合成酶的对热不稳定性限制，只能进行类似PCR前两个周期反应的单纯且少量的基因复制[1]。1976年从热泉Hot spring中的细菌(Thermus Aquaticus) 分离出来Taq polymerase是现今所使用的酶的雏形，它的耐高温的特性符合 PCR 的反应要求，但其应用于 PCR 技术直至 PCR技术理论的成型又在其后进行了多年的探讨[2]。1985 年，Dr. Kary B. Mullis经多年的研究论证并与 Saiki等人发表了 PCR 技术应用的论文。此后，PCR 技术的发展日趋完善，应用的范畴日趋扩展。直至 1995 年由美国 PE公司首先研制成功了荧光定量 P C R （也称 T a q M a n PCR,以下简称 FQ-PCR）检测仪，它融汇了 PCR的灵敏性、D N A 杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，并能做到电脑同步跟踪，数据自动化处理，直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果，实现了完全闭管操作。
聚合酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction）是利用 DNA片段两端的两个短的单链引物，应用热稳定的聚合酶，通过双链 DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，在体外对特定核苷酸片断进行指数级扩增的技术。早期的PCR技术在扩增反应结束之后，可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过光密度扫描来进行半定量的分析。无论定性还是半定量分析，分析的都是PCR 终产物。此时的定量 PCR 技术的难点主要在于：
1）如何确定 PCR 正处于线性扩增范围内。因为只有在此范围内 PCR 产物信号才与初始模板的拷贝数成比例。
2）一旦线性扩增范围确定以后，如何找到一个合适的方法检测结果。因为在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR信号放大之前的起始模板量。为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的 cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整，在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。
FQ-PCR即在普通的 PCR 反应中加入荧光修饰的探针，探针标记除用 TET 和 FAM 外，还可用HEX、JOE作为报告荧光，3′端的淬灭基团常用TAMRA。在探针保持完整时，荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭，而在探针被切断后，荧光报告基团才发出报告荧光，且荧光的强度与PCR 产物的数量呈正比。随着 PCR 反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到一个荧光信号的波长和长度变化。这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，实时得到一条荧光扩增曲线（参见图1，使用北京英贤仪器有限公司实时荧光定量PCR 分析仪INCE-8000），因此也称之为 Real-time-PCR（RT-PCR）。RT-PCR 的应用范围很广泛，包括mRNA 表达的研究、DNA 拷贝数的检测、单核苷酸多态性（SNPs）的测定等。

PCR 本身虽然是一个单纯的实验技术，即 PCR反应中各种成份在变性、退火、延伸的温度循环中，对 DNA模板进行指数级扩增。因此，变性、退火、延伸的温度高低及时间长短，反应中的各种成分( T a q . Polymerase,primers, dNTPs, MgCl2 )的浓度及纯度、性能都影响着 PCR 增幅的效果。

为了明确 Taq酶的不同对反应结果的影响，我们使用北京英贤仪器有限公司实时荧光定量PCR分析仪INCE-8000，进行了如下试验：温度循环为 95 —60°C二步法，时间设定相同，反应组成（DNA模板，Primer，TaqMan-Probe，dNTP，MgCl2）及终浓度相同，只是分别使用了不同厂家的Taq酶及其相应的反应缓冲液，反应结果参考图2、3 及表 1、2。

此结果表明不同的Taq酶导至反应结果的灵敏度会产生明显差异，因此对基因表达偏低的样本进行定量检测时，有必要选择使用扩增效率高的Taq 酶，从而提高 PCR 扩增反应的阳性率。





我们知道不同PCR 系统的检测极限也不相同：有灵敏度可达一个拷贝的；也有灵敏度只可达1000个拷贝的；还有更低的。但利用同一PCR检测系统，对PCR反应结果的影响因素就以 Taq 酶为关键。

Taq 酶在 PCR反应中所起的作用是利用其 3′→ 5′聚合酶活性以 DNA 为模板，将 dNTP 中的脱氧单核苷酸逐个加到 3-OH 末端；同时利用其5′→3′外切酶活性即能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关，又可以从5’端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。由此在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的探针切断，故可进行定性与定量检测。
Taq酶由水栖高温菌（Thermusaquatics）YT1蓖株中分离而得。此菌于1969年由Brock分离自美国黄石公园温泉，作为栖热杆菌的标准菌株，其生长温度为70～75，有实验表明Taq 酶活性在热启动以后的半衰期为：97时 20 分钟、95时 40 分钟、94时 60 分钟、92时 90 分钟。半衰期后 PCR扩增效率迅速降低为接近零。
发展至今 T a q 酶已可用基因重组的方法生产，Cetus公司生产的商品名为AmpliTaq，其完整基因长2499bp，在大肠杆菌中表达生产，含832个氨基酸。在氨基酸序列上与大肠杆菌 DNA 聚合酶有 38%是一致的，包括对 dNTP 结合，引物与模板作用区均存在于 Taq 酶中。
第二代耐热DNA聚合酶Stoffel片段则是Cetus公司的Stoffel将TaqDNA聚合酶的5’→3’外切酶活性片段（N端289个氨基酸）去除，称为stoffel片段。其97.5的半衰期从 Taq DNA聚合酶的 5～6min 提高到20min，同时该酶片段也对两个或更多模板位点的扩增反应即复合 PCR（MultiplexPCR）更为有利。
VentTM DNA多聚酶：是美国New England Biolabs公司从潜水艇排气孔（Vent）中分离的超级嗜热菌-能生长于98中的Thermococcus litoralis中分离纯化得到的，故名Vent酶。它的一些酶学性质较 Taq DNA聚合酶更为优越，它能耐100高温且2h以上仍有活力，并且具有 3’→5’外切酶活性的校正能力，错误扩增的机率比 Taq 酶降低一倍。
近年，经过基因改造的Hot Start TaqDNA聚合酶，因其低温时酶没有活性，94-95加热后开始反应，从而抑制了低温条件下的非特异性扩增，大大提高了PCR反应的特异性，同时HotStart Taq DNA 聚合酶能为 PCR 反应提供更高的产量及灵敏度、特异性，已逐渐成为 PCR 技术的主流。
Taq酶的种类繁多，有稳定性好的，有特异性强的，有保真性好的，有错配率低的，有扩增效率高的等等，因此要根据实验目的的要求有选择性的使用Taq 酶是实验成功的关键。
参考文献
[1]Chien A, Edgar DB,Trela JM. Deoxyribonucleic acid polymerasefrom the extreme thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol1976;127:1550-7
[2]Saiki RK, et al. Enzymatic amplification of beta-globulinge-nomic sequences and restriction site analysis for the diagnosisof sickle cell anemia. Science 1985;230:1350-4

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