基于呼吸检测的癌症早期诊断技术研究进展

莺歌燕舞

近年来，癌症已经成为发达国家居民的首要致死因素和发展中国家居民的第2致死因素。并且随着老龄化人口的增加，发展中国家的癌症负担也在不断加重。早期检测和治疗可以有效降低癌症的死亡率。目前，癌症的早期诊断依赖于对高危人群的定期体检，检测技术目前主要包括痰细胞学、肿瘤标志物学、血液蛋白组学和医学影像技术。

       X线胸片很难检测到较小的结节，且无法发现早期肿瘤，假阴性率较高，痰细胞学检查也存在此问题。CT检测灵敏度高于胸片，但当结节直径小于1 mm时，容易出现假阳性结果。CT检查可以有效发现早期癌症，却并没有遏制癌症发展或降低死亡率，这主要是因为CT检查在一定程度上给患者带来了射线损伤。

       肿瘤标志物浓度受人体多种因素的影响，单一标志物检测也无法满足早期诊断的需要，多标志物联合诊断有望克服这一缺陷，但标志物的筛选和诊断模型的建立仍处在探索阶段。另外，血液样本组成成分相对复杂生化检测前的预处理步骤繁琐，也阻碍了其临床应用的推广。

       近年来，用于肿瘤检测的呼吸诊断技术受到了广泛关注，被认为是解决上述问题的有效手段。呼吸样本的采集过程简便无创，较容易被受试者接受。同时，大量研究表明呼出气体中可以检出上述肿瘤标志物，且标志物浓度与肿瘤的存在情况密切相关。

       这一技术包括两个方面：一是直接采集呼出的气相成分，检测其中的挥发性有机化合物(volatileorganic compounds，VOC)；二是将呼出的气流冷凝下来，以呼出气体冷凝物(exhaled breath condensate，EBC)形式采集，检测其中的肿瘤标志物。本文对上述两种形式的检测技术及其在肿瘤早期诊断中的研究成果和应用前景进行综述。

1 利用动物嗅觉识别早期癌症技术的发展

       在呼吸诊断技术多年发展的基础上，1989年Williams和Pembroke首次提出了借助犬类强大嗅觉系统来检测恶性肿瘤的猜想。

       2004年Pickel 等训练1只4岁的雄性雪纳瑞犬和1只6岁的雌性黄金猎犬对7例黑色素瘤患者进行识别。雪纳瑞犬对前5例患者的识别结果与临床医师的判断及组织活检结果一致；第6例患者被雪纳瑞犬认为其皮下存在黑色素瘤，尽管临床上也怀疑其为黑色素瘤患者，但组织活检的结果为阴性。

       临床医师和雪纳瑞犬都没有对第7例患者的情况给出确定判断，但随后的组织学检查结果为阳性。黄金猎犬对7例患者中的4例进行了识别，结果与雪纳瑞犬的判断一致。

       2006年McCulloch等用食物奖励方法训练5只普通家犬，让其区分55例肺癌患者、31例乳腺癌患者和83例健康受试者的呼吸样本。结果显示，犬检测肺癌的灵敏度和特异度都达到99％，而检测乳腺癌的灵敏度和特异度分别为88％和98％。

       Ehmann等用同样方法训练4只家犬，训练过程中只使用肺癌患者和健康对照者的呼出气体，测试时加入慢性阻塞性肺疾病患者的呼出气体，结果显示犬检测肺癌的灵敏度和特异度分别为71％和93％，并且由于加入了慢性阻塞性肺疾病对照组，使得这次实验的特异性更具说服力。

       利用动物嗅觉检测人类恶性肿瘤的研究涉及多种恶性肿瘤类型，检测准确度较好，可有效用于肿瘤的早期检测。由于经过训练的动物可以在一段相当长的时期内对多个标本进行识别，而不需要使用试剂盒等其他耗材，因此该方法的检测成本也明显低于现有的生化检测方法。

2 利用组学技术确定呼出气体中的肿瘤标志物

       虽然利用动物嗅觉可以进行肿瘤早期检测，但这种方法仍存在明显缺陷，训练动物流程的复杂性、不同动物个体判断的主观差异性等因素使得该方法难以在临床上实现大规模普及。作为临床诊断的辅助手段，要求检测技术能提供数据和图形等细致的输出结果。

       而动物嗅觉检测则只能输出“是”或“否”，无法提供细化指标供临床医生综合其他症状和检测结果做出最终判断。仪器检测可以克服以上问题，而肿瘤标志物组合的优化可以从本质上提高仪器检测的精度。

       组学研究作为当代分子生物学研究中最热门的技术之一，不仅能够用于标志物组合的筛选，还可以用于标志物产生机制研究。基因组学、蛋白组学、代谢组学在呼出气体检测中应用最为广泛，旨在筛选特异性的生物标志物和识别未知样本的信号模式。

2.1 基因组学研究的现状

       为什么哺乳动物可以通过嗅觉系统识别出癌症的发生?有学者提出恶性肿瘤产生的挥发性成分可能与人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HIA)表达的改变有关。这一设想需要从两个方面寻找支持的证据：(1)人体的气味是由人类主要组织相容性复合体(MHC)决定的，HLA的表达受控于MHC基因簇；(2)HLA表达的改变与癌症强烈相关。而实际上MHC基因确实决定了人体的气味，这些气味可能会影响到个体识别和交友行为。

       另外，也有研究表明HLA的表达在癌细胞与免疫系统的相互作用中起决定性作用，HLA在细胞表面表达的改变是肿瘤细胞逃脱免疫识别的机制之一。因此，通过研究MHC基因相关气味就有可能实现癌症的早期诊断。Montag等使用电子鼻检测了鼠类MHC相关气味，为这一癌症检测新思路的实现奠定了基础。

       基因组学的相关研究一般是直接检测EBC中的相关基因，比气态呼吸样本的研究更为直观。1998年Gessner在肺癌患者的EBC中检测到K-ras基因突变。之后，他们收集了18例非小细胞肺癌患者和18例非吸烟正常健康人的EBC，PCR扩增检测发现11例患者和10例健康人样本中β-actin阳性，其中4例患者样本检测到p53基因突变，而健康人样本中则未发现p53突变。

       Carpagnano等研究表明EBC中微卫星DNA改变与肺癌显著相关，且EBC和肺癌组织中的微卫星结构表现一致，说明EBC的基因组学研究可以反映机体内DNA改变。遗憾的是，相关研究似乎只集中在肺部癌症的检测上，这可能与EBC含水量过大、物质浓度过低有关，其他部位癌症引起的呼出气体成分改变显然不如肺癌，在现有技术条件下很难检测到。

2.2 蛋白组学研究的现状

       因为其他部位肿瘤细胞分泌的蛋白标志物需要经循环系统后才能在呼出气体中有所表达，所以检测EBC中的标志物更有利于肺癌的早期诊断。

       Dalaveris等检测了EBC中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)的含量，结果表明肺癌患者EBC中TNF-α浓度显著高于正常人，VEGF浓度虽然在两组人群中的差异并不显著，但它在非小细胞肺癌早期患者和晚期患者EBC中的浓度差异显著。

       Zou等引用化学发光免疫分析方法检测了105例肺癌患者和56例健康人的EBC和血清中的癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)抗原和神经元特异性烯醇化酶neuron specific enolase，NSE)浓度，结果显示这几种肿瘤标志物在肺癌患者的表达明显高于健康人，且EBC与血清中这几种肿瘤标志物对肿瘤组织学类型的特异性是一致的，EBC中的CEA在非小细胞肺癌早期患者中的表达高于血清CEA。

       这一结果与前期猜想一致，证实了肺癌相关标志物在呼吸系统中先于在循环系统中检出，检测EBC中肿瘤标志物是一种具有较大应用前景的肺癌早期筛查手段。

       2008年Kullmann等首次真正意义上将蛋白组学技术用于肺癌患者EBC检测，他们运用抗体微阵列分析对EBC中的120种细胞因子进行了检测，发现嗜酸粒细胞趋化因子2(eotaxin一2)、eotaxin-3、成纤维细胞生长因子6(FGF-6)、FGF-7、FLT-3L、IL-10、CCL-28、GRO-α、巨噬细胞炎症蛋白3 (macrophage inflammatory protein 3，MIP-3)等9种细胞因子在肺癌组和健康组的表达水平相差2倍以上。

       这项研究为探索EBC中的癌症标志物提供了一个方向，但EBC中具有肿瘤识别作用的蛋白标志物远不止9种，其他蛋白的检测、多种蛋白标志物组合的确定等都需要进一步的研究。

2.3 代谢组学研究的现状

       呼出气体中的大部分分子都是代谢产物，因而代谢组学对于癌症标志性呼出气体成分的研究至关重要。机体通过非酶系统和酶系统两条通路调节氧化应激，改变内源性VOC的产生种类和比例，反映在呼出气体中就是产生新的VOC组合模式。利用呼吸测试实现幽门螺杆菌的检测就是代谢组学的研究成果之一，并且已经被广泛应用于临床。

       人体细胞中不存在尿素酶，幽门螺杆菌能产生大量尿素酶，受试者服用含有同位素13C的尿素后，幽门螺杆菌感染患者的胃内含有尿素酶，分解产生含13C的二氧化碳可以从呼出气体中检测出来。90％的胃癌患者伴有幽门螺杆菌感染，因此这一方法也可以有效用于早期胃癌的筛查。

       此外，有研究报道通过呼吸测试来检测乳腺癌、前列腺癌和直肠癌，但这些研究，特别是针对前列腺癌和直肠癌的研究，多数是通过使用非特异性传感器来实现的，并没有真正找到肿瘤对应的标志性VOC，造成这种现象的主要原因是机体受肿瘤影响的代谢过程并不明了。

       在正常受试者中可以检测到超过3 000种不同VOC，但只有20～30种在所有受试者的呼出气中同时存在。这些VOC组合的差异性与代谢过程的个体差异有关，呼出气体中VOC的不同组合携带了大量生理信息，通过研究这些组合，将提供更多疾病的诊断方法。

3 用于呼吸诊断的新型传感器技术的发展现状

       动物嗅觉检测技术需要专业的饲养员和训练员，而色谱、质谱和酶标仪等仪器检测技术则需要专业的分析师，这些方法对技术人员的依赖性阻碍了其在临床上的普及。

       并且，标准仪器一般都造价不菲、体积庞大、需要大量耗材，因而开发更具针对性的小型化、低成本且操作简便的呼吸检测仪器成为一项迫切需求。近年来，新型呼吸检测传感器的研究发展迅速，主要发展方向包括纳米传感技术、阵列式复合传感技术和生物电子鼻技术。

3.1 纳米传感技术

       2009年Peng等报道了一种单阵列的纳米金颗粒化学电阻传感器用于肺癌的诊断，传感器阵列使用5nm的纳米颗粒，同时结合了9种不同的有机配体。利用主成分分析(principal component analysis，PCA)对传感器阵列的响应数据进行处理，可以较显著地区分肺癌患者和正常人群，从而建立了一种快速、可靠且无创的肺癌诊断方式。

       随后，他们将该技术进一步发展，扩大传感器阵列，将9种配体增加为14种，实现了对肺癌、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌患者和健康人群呼吸样本的快速区分。

       目前，EBC的研究还处在起步阶段，检测过程多利用标准化分析仪器进行。另外，EBC中标志物浓度过低，也是相关传感器检测较为罕见的原因之一。Lee等报道了一种利用纳米金颗粒催化特性的表面声波surface acoustic wave，SAW)免疫传感器，用于检测血清心肌肌钙蛋白I、肌酸激酶MB和肌红蛋白的浓度。

       微流控和金染色技术有效地起到了提高传感器灵敏度的作用，蛋白检测的灵敏度达到μg/L级别。目前本课题组也做了相关探索，利用这项技术实现了对EBC中肺癌标志物的检测。

3.2 阵列式复合传感技术

       虽然多数诊断系统都使用了整合多个传感元件的检测阵列，但是每种类型的传感器都有自己固有的劣势，因而单阵列传感器仍难以满足广谱检测的需求。

       Ulmer等设计实验验证了复合型电子鼻的优势，实验使用了2种传感器单阵列和1种复合型传感器器件：(1)含8个金属氧化物传感器(metal oxide sensors，MOS)的模块阵列(MOX)；(2)1个基于石英晶体微平衡(quartz microbalance，QMB)的质量敏感模块；(3)1种复合型传感器器件——MOX结合QMB。

       他们用这3种器件检测了100 ppm(partpermillion)的戊醛、己醛、庚醛、辛醛和壬醛，空白组为纯溶剂。用PCA对传感器响应进行模式识别，显示只有在MOX结合QMB的复合模块检测下，6组样本才能得到完全区分。这表明在具有高可靠性和高特异性要求的复杂气体分析中，复合传感器的使用有利于排除个别样本重叠的问题。

       在传感器系统中使用多个不同传感原理的器件，同时利用多种器件的不同特异性，可以有效提高数据质量，这将会是新一代商业电子鼻的发展趋势。

       本课题组设计了一种基于MOS和SAW的复合型电子鼻用于肺癌诊断。MOS阵列对小分子的VOC更为敏感，而SAW器件则适合大分子VOC的检测，两种器件的配合使用有利于实现呼出气体的广谱检测。我们利用该系统分析了23例健康人和25例肺癌患者的呼出气体样本，结果表明复合型电子鼻的使用可以有效提高2组人群的区分度，实现更为准确的肺癌诊断。

       但是，复合型电子鼻由于整合了多个不同类型的传感器件，可能引入不同结构特征的数据，从而导至单一的特征值提取方法无法直接用于多个器件；同时，多器件直接导至多特征值，这可能会引起运算速度和识别精度的下降。如果将无效数据引入到模型中，如何避免数据冗余并实现快速诊断，也是摆在研究者面前的一道难题。

3.3 生物电子鼻技术

       动物嗅觉检测技术在肿瘤诊断中取得的成绩引起了研究者的关注，他们认为，相比于仪器系统，哺乳动物的嗅觉系统更加复杂、精确，在呼出气体的检测中具有明显优势。

       因此，学者们提出了将生物嗅觉系统和仿生电子鼻系统结合起来构建生物电子鼻，希望通过动物嗅上皮细胞感知气味分子，使用植人式多通道电极记录生物嗅觉系统产生的神经电生理信号，继而通过模式识别技术实现肿瘤的诊断。

       对此，本课题组建立了一套记录大鼠嗅觉系统的神经电生理信号、分析其编解码机制、进而识别大鼠嗅觉信息的方法。通过手术移去大鼠嗅球上方2 mm×2 mm大小的颅骨后，将电极植入到嗅球300～400仙m的深度，再将电极连接到信号采集系统实现信号的实时显示和记录。

       该系统是具有128通道滤波放大和数据采集功能的独立工作站，通过微型前置放大器读取原始信号将其进行模一数(Analog／Digital，A/D)转换，并将转换后的数字信号传送到电脑进行记录、显示和分析。

       重复实验记录在甲醚、香芹酮、柠檬醛和异丁醇4种单成分气味刺激下20只麻醉大鼠的126个嗅球僧帽一丛状神经元信号，并采用K最邻近分类算法对4种气味信号进行分析，结果表明大鼠对4种气味的识别准确率分别为90％、83．3％、66．7％、70％，这一实验结果有力地提示了肺癌呼吸检测生物电子鼻的可行性。

       将嗅觉灵敏的哺乳动物作为气体“敏感元件”，通过记录分析其受肺癌患者呼出气体刺激前后嗅球神经元产生的动作电位，建立有效的VOC检测模型。当其受到被测者呼出气体刺激时，通过VOC检测模型来进行判断，从而实现临床诊断肺癌的目的。

       这种方法相比于直接的动物嗅觉检测免去了动物训练环节，而且VOC检测模型适用于同种动物的不同个体，大大节约了时间成本，尤其是对于不易训练的动物。由于呼出气体样本一般是上百种VOC的混合物嗅觉系统在呼出气体刺激下的响应信号是这些混合物共同作用的结果，所以对这一复杂信号的解码工作将是下一步研究所面临的关键问题。

4 结束语

       恶性肿瘤是威胁人类生命健康的最主要原因之一。现有的体检筛查手段包括痰细胞学检测、血清肿瘤标志物检测、x线摄片和CT扫描等，前3项检查方法具有较高的假阴性率，且无法检测早期肿瘤，容易错过最佳诊断时间；CT扫描可以检测直径只有1 mm的肿块，但无法区分肿块性质，会带来大量假阳性结果，导至不必要的组织活检。

       而基于呼吸检测的肿瘤诊断技术，不仅可以实现快速、无创诊断，还可以从机制上避免假阳性和假阴性结果的产生，这是由于呼吸检测的标志物确定是在3大组学研究的基础上进行的，充分考虑了良性肿块和恶性肿块的不同代谢途径，并且基因组学技术的应用有效地促进了肿瘤早期检测的实现。

       动物嗅觉检测技术可以检测到早期恶性肿瘤，但过程复杂且重现性低，难以实现临床应用，只能作为探索式的研究手段，为呼吸诊断研究指明方向。

       组学研究是基础研究领域的常用手段，方法经典、可信度高，可以为标志物的选取提供理论依据；并且，很多用于蛋白和基因检测的大型仪器设备已经进入临床，可以直接用于呼吸中对应标志物的检测，所以基于组学研究的呼吸诊断技术的临床应用前景十分可观。

       与大型生化分析仪器相比，传感器技术可以提供低成本、高效率的检测方法，但符合临床安全规范和精度要求的传感器系统相对较少，因而其发展道路还相当漫长。近20年呼吸检测技术已经取得了快速发展，但目前作为商业化仪器进入临床应用的只有幽门螺杆菌检测和哮喘呼吸检测两类仪器，其他疾病的检测，特别是癌症早期快速诊断仪器仍在研究和发展中。

       近年来，随着动物嗅觉检测技术、生物组学技术以及新型传感技术的快速发展，为呼吸检测领域的研究注入了新的活力，再次掀起了该技术的研究热潮，相信在不久的将来，该领域一定会迎来一系列重大的技术进步和突破。

文章摘自《中华生物医学工程杂志》2014年2月第20卷第一期p66~69

文章作者：邹莹畅 张希 庄柳静 陈星 胡燕婕 应可净 王平