在分子诊断领域，核酸检测是病原体识别和传染病管理的核心技术之一。无细胞诊断系统摆脱了活细胞培养需求，把RNA传感、蛋白表达和信号输出压缩到一个冻干反应体系中。以toehold switch为代表的RNA调控元件，已经被广泛用于寨卡、登革热、埃博拉、肠道微生物群等多种目标的检测。但这些riboregulator在面对不同病原体时，需要依赖复杂的建模和实验微调，不同目标之间并不能简单平移。这使得它们在应对快速变化的检测场景时，扩展性受到明显限制。 近日，中国第三军医大学西南医院在杂志Nature Communications上发表了一篇题为 “De novo-designed ribozyme-controlled riboregulator for cell-free diagnostics”的文章。作者开发了一种名为TRACKer的无细胞诊断平台，将无细胞RNA诊断的目标识别、核酶开关和信号输出模块化，只要更换识别模块，即可检测多种不同RNA目标，极大提高了系统的通用性能。研究显示，该系统可在70分钟内，在不进行核酸预扩增的情况下实现病原RNA检测，对6种呼吸道病毒实现1–10 aM级别的灵敏度，并可通过发光定量或侧向层析试纸两种方式输出结果。
图片来源：Nature Communications
TRACKer系统的工作原理概述 TRACKer整个系统由两条RNA组成，一条是IRS，另一条是switch strand。其中，IRS承担两个功能，一部分用于抑制核酶活性，另一部分用于识别目标RNA。switch strand包含被封存的RBS和报告蛋白编码序列。在没有目标RNA时，IRS与switch strand结合，把核酶维持在OFF状态，此时RBS被遮蔽，核糖体无法结合，报告蛋白也就不会翻译。当目标RNA出现后，它先与IRS上的识别区结合，并通过竞争性链置换把IRS从switch strand上分离。这一过程解除对核酶的抑制，并切开底物区域，最终暴露RBS，允许核糖体进入并翻译报告蛋白，产生可检测信号。 这种设计把目标识别与翻译进行了功能上的相对解耦。目标RNA先通过IRS触发核酶从OFF转为ON，再由核酶触发翻译，使该系统更容易模块化重编程。因此，TRACKer可分解成三个模块，核酶变构模块、核糖开关激活模块以及输出模块。
TRACKer系统的工作原理。图片来源：Nature Communications
TRACKer系统的优化 为了使IRS在没有目标时抑制核酶活性，目标存在时被有效置换，作者采用了HH15 ribozyme作为骨架，并设计了不同长度、不同位置互补的IRS。结果显示，IRS与核酶之间的互补长度是决定抑制效率的主要因素，IRS与HH15之间10–18 nt的互补长度，比如IRS18-1可以达到最优性能（如下图）。 作者选择了HiBiT作为TRACKer的报告系统，因为它结构小、折叠快、背景低，而且灵敏度高。TRACKer的高灵敏度并不是来自核酸扩增，而是来自无细胞蛋白合成的级联放大+ HiBiT/LgBiT高效发光输出。经过优化，作者确定了反应条件，IRS:switch = 50:1、31°C预孵育、40 mM Mg²⁺ 和40分钟无细胞表达时间。这些条件可被推广到后续广泛的病毒检测中。
IRS链的筛选和优化。图片来源：Nature Communications
TRACKer的通用性及检测性能验证 建立起TRACKer系统的模块化设计后，作者将TRACKer扩展到6种常见呼吸道病毒FluA、FluB、RSV、HPIV、HrV 和 SARS-CoV-2。根据这些病毒的保守区域，选择便于IRS识别的靶区，并针对每个靶区替换IRS和连接序列，即可构建出目标特异性的TRACKer版本。结果显示，6种TRACKer系统在对应目标存在时都能产生明显发光信号，并且在60分钟内保持稳定。不仅如此，结构化RNA发卡、miRNA以及细菌耐药基因等同样能作为TRACKer的靶标。 作者对6种呼吸道病毒分别进行合成RNA滴定，结果表明，TRACKer可在1 aM 到 10 fM 的范围内表现出清晰的浓度依赖性信号变化。对所有6种病毒，检测下限均可达到1–10 aM（下图a–f）。 作者用FluA进行了特异性方面的深入分析。结果显示，每个系统都只对自己的目标RNA强烈响应，对其他非靶病毒几乎无交叉激活，在测试范围内没有串扰问题。
TRACKer的通用性及检测性能验证。图片来源：Nature Communications
TRACKer的临床样本验证 为了验证临床可用性，作者使用FluA、HrV和RSV阳性与阴性的临床咽拭子样本对TRACKer进行了评估。盲法验证的结果显示，TRACKer对FluA的表现最好，灵敏度100%、特异性94.8%；对HrV的灵敏度和特异性分别为90%和92%；对RSV 的灵敏度和特异性分别为88.9%和96.4%。总体与RT-qPCR的一致性达到 88.9–100%（如下图）。
TRACKer的临床样本验证。图片来源：Nature Communications
TRACKer-LFA版本虽灵敏度下降，但更适合现场使用 除了实验室版的HiBiT发光输出，作者还开发了一个更适合现场使用的 TRACKer-LFA 版本。LFA版本同样可以区分6种呼吸道病毒，有较好的特异性。在FluA实验中，可稳定检测到 4 pM，与实验室版1–10 aM的HiBiT发光输出相比，LFA版本的灵敏度明显下降到了pM量级。在 Ct < 30 的中高病毒载量样本中，TRACKer-LFA对FluA实现了92.3%阳性符合率和100%阴性符合率（如下图）。
TRACKer-LFA 的现场应用。图片来源：Nature Communications
这篇文章引入一种模块化的设计思路TRACKer，把目标识别和翻译激活之间，通过一个可被竞争性链置换控制的核酶开关连接起来。只要更换识别序列和连接区，这套框架可以被重新编程去检测多种不同RNA目标。TRACKer在70分钟内，无需核酸预扩增，即可达到1–10 aM的灵敏度，且既可以在实验室用HiBiT实现高灵敏定量，也可以在现场用LFA实现更简化的可视化检测。 这项工作也有一定的局限性。计算工具对RNA三级结构的预测有限，因此计算设计与实验结果之间可能存在偏差。此外，现场LFA版目前主要适用于中高病毒载量样本，对低载量感染的检测能力仍需提高。临床样本验证的规模和病种范围也仍有限，距离广泛应用还需要更多多中心和前瞻性研究。总之，这篇文章将无细胞RNA诊断的目标识别、核酶开关和无细胞表达模块化，只要更换识别模块，即可检测多种不同RNA目标，极大提高了系统的通用性能。 |
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