【专家论坛】肿瘤分子诊断技术的发展与前景

近年来，肿瘤分子诊断技术迎来了飞速发展。传统肿瘤分子诊断的技术主要为荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）。FISH被认为是检测DNA重排的金标准，PCR主要用于检测已知特定的基因组改变。然而，随着肿瘤分子靶点的不断发现，传统技术已无法满足“高通量”及“特殊靶点”的检测需求。二代测序（next generation sequencing，NGS）技术的发展，为肿瘤分子诊断提供了新的利器。欧洲肿瘤内科学会（European Society for Medical Oncology，ESMO）建议在晚期非小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌和胆管癌中常规使用NGS ^{［ 2 ］} 。2017—2022年，NGS用于指导肿瘤靶向治疗的比例从18.1%增加至35.9% ^{［ 3 ］} 。值得注意的是，NGS检测范围也在不断拓展，从最初的小型基因组合（几个到十几个基因），到后来的大型基因组合（数十个到上百个基因），再到全外显子测序（whole-exome sequencing，WES）与全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）。

液体活检技术的发展在肿瘤分子诊断领域具有里程碑式的意义。自2010年提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）以后，液体活检的概念不断拓展，如今已涵盖CTC、循环肿瘤核酸、细胞外囊泡、肿瘤教育血小板等。液体活检的检测范围也从最初的血液延伸至各种体液，包括尿液、脑脊液、痰液、唾液等。近期，有学者提出，微生物组在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用，应将循环微生物组也纳入液体活检的概念 ^{［ 4 ］} 。

1998年曲妥珠单抗的获批标志着肿瘤靶向治疗时代的开启，而此时的肿瘤分子诊断主要专注于晚期肿瘤的分子分型与用药指导。随着二代测序以及液体活检技术的发展，分子诊断的临床应用逐渐覆盖肿瘤诊疗全流程，包括：伴随诊断、复发监测以及早筛早诊。

1.肿瘤伴随诊断：伴随诊断能够筛选出最适合特定治疗的人群，提高治疗效果并降低用药风险。《新型抗肿瘤药物临床应用指导原则（2022年版）》指出约50%的抗肿瘤靶向药需要伴随诊断。截至2023年8月，FDA批准的具有伴随诊断的药物数量超过60种 ^{［ 5 ］} ，主要集中于肺癌、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤，涉及的检测技术主要为PCR、FISH、免疫组化（immunohistochemistry，IHC）以及NGS。目前，大部分伴随诊断产品针对组织样本，为了弥补组织不可获得的情况，陆续有液体活检伴随诊断产品问世。2018年，中国国家药品监督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）批准了首个液体活检伴随诊断试剂，用于指导晚期非小细胞肺癌靶向治疗，基于液体活检的表皮生长因子受体基因突变检测也被纳入了国内外肺癌诊疗指南 ^{［ 6 , 7 ］} 。

2.肿瘤复发监测：高灵敏度液体活检技术的发展，为实体瘤复发监测提供了新的手段。微小残留病（minimal residual disease，MRD）的概念起源于血液肿瘤，在实体瘤中是指传统影像学不可检测而液体活检技术可检测到肿瘤相关分子异常的情况。大量国内外研究证实，基于液体活检技术的MRD检测能早于影像学发现肿瘤复发 ^{［ 8 ］} 。2021年，国外Natera公司的MRD检测产品获FDA突破性认定。同年，基于循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的MRD检测被写入结直肠癌指南，用于评估肠癌术后复发风险 ^{［ 9 ］} 。尽管国内陆续推出了近20款MRD检测产品，但均未获得NMPA批准。

3.肿瘤早筛早诊：受限于传统筛查技术的局限性，肿瘤早筛早诊的需求长期未得到满足。肿瘤分子诊断技术的发展为肿瘤早筛早诊提供了新的机遇。2014年，FDA批准首个基于分子诊断的肿瘤早筛产品（Cologuard），用于结直肠癌的筛查。目前，NMPA也陆续批准了十余款肿瘤早筛产品，主要用于肠癌及肺癌的单癌种早筛早诊，涉及的检测技术均为PCR。近年来，基于液体活检的多癌肿早期诊断（multi-cancer early detection，MCED）成为了肿瘤早筛领域的热点和突破口。MCED通过检测血液中的肿瘤相关分子标志物，可从单一检测中识别多种癌症 ^{［ 10 ］} 。目前，多癌肿筛查产品的研发大多采用NGS技术，主要检测血液中的ctDNA（包括DNA甲基化、突变、片段化模式等），也会以多组学的模式联合检测其他生物标志物（如蛋白质） ^{［ 11 , 12 ］} 。遗憾的是，国内暂无获批的多癌肿早筛早诊产品。

4.新型肿瘤临床研究：分子诊断技术的发展、新型肿瘤标志物的发现、新型抗肿瘤药物的研发，三者互相推动，形成闭环。在精准肿瘤学时代，同步开发伴随诊断与抗肿瘤治疗药物的模式越来越受到关注。1998年，FDA同步获批曲妥珠单抗与其伴随诊断试剂盒HercepTest，并规定转移性乳腺癌患者接受曲妥珠单抗前必须采用HercepTest检测肿瘤HER2蛋白表达情况。2014年，FDA发布伴随诊断的指导文件，提出伴随诊断及靶向药物同步开发的必要性 ^［ 13 ］ 。2020年起，我国也陆续出台了伴随诊断临床试验的相关指导文件。如今，我国靶向治疗与伴随诊断的同步开发模式已具雏形，逐渐成为伴随诊断开发的主流模式。

与此同时，以生物标志物为中心的新型临床试验为肿瘤研究提供了新的思路。精准肿瘤学研究中，最具代表性的创新临床实验设计是伞式和篮子研究 ^{［ 14 ］} 。伞式研究是针对同一类型肿瘤，根据生物标志物分为不同亚组，分别给予相对应的治疗方案，如肺癌Lung-MAP研究。篮子研究是针对具有相同分子改变的不同类型肿瘤，给予相同的抗肿瘤治疗方案，如NCI MATCH研究。这些新型临床试验大大加速了新型抗肿瘤药物的研发与获批，尤其是针对罕见靶点的药物。基于分子诊断的干预性临床试验也是近年来的研究热点，根据分子标志物的状态评估肿瘤负荷，从而给予不同的治疗策略。以DYNAMIC研究为例 ^{［ 15 ］} ，对于Ⅱ期结直肠癌患者，术后ctDNA检测阳性组接受辅助化疗，阴性者只需随访观察。基于分子诊断的临床试验，进一步促进了肿瘤的精准化管理。

肿瘤分子诊断领域的新技术仍不断涌现，包括三代测序、单细胞测序、空间组学。人工智能与分子诊断技术的结合，为精准肿瘤学提供了全新的视角。然而，新技术实现临床应用的过程远远滞后于技术本身的进步。

1.肿瘤分子诊断新技术仍不断涌现：肿瘤分子诊断技术从最初的单/寡靶点时代，逐渐过渡到了如今NGS为主流的多靶点时代。随着分子生物学的进步，涌现了大量创新技术，包括三代测序、单细胞测序、空间组学等，为肿瘤研究提供了更多维度的信息。其中，最具临床应用前景的是三代测序技术。三代测序又称为长读长测序（long read sequencing，LRS），可实现1 000~1 000 000 bp的测序读长，而NGS的读长通常仅为100~150 bp。三代测序能弥补NGS的许多检测局限性，如结构变异、基因组重复区域变异、高GC含量区域变异、基因组修饰等 ^{［ 16 ］} 。目前，可用于三代测序的平台有2个，分别是Pacific Biosciences（PacBio）和Oxford Nanopore Technologies（ONT）。由于准确性、价格等多种因素，三代测序目前仍以研究目的为主，尚未正式应用于临床。

随着测序技术、多组学技术在肿瘤中的应用，如何从指数级增长的数据中提取有价值的信息成了棘手的难题。人工智能可整合多维数据，更精确地提取肿瘤信息，在挖掘肿瘤靶点、辅助临床决策等方面将发挥重要作用 ^{［ 17 ］} 。其中，最值得关注的领域是AI结合液体活检技术在肿瘤早筛早诊中的应用，如用于肺癌早筛的Lung-CLiP以及多癌肿早筛的CancerSEEK ^{［ 18 , 19 ］} 。

2.新技术实现临床应用的挑战：尽管肿瘤分子诊断技术的蓬勃发展，为肿瘤精准诊疗带来了前所未有的曙光，然而真正实现临床应用的新技术寥寥无几。以NGS为例，截至2024年3月，NMPA获批的肿瘤NGS检测试剂盒仅十余项，均为小型基因组合（2~10个基因），不仅同质化严重（以肺癌、肠癌伴随诊断为主），且缺乏液体活检产品。

新技术难以实现临床应用的原因来自多个层面。首先，是检测技术标准化的问题。以NGS与液体活检项目为例，不同项目在检测指标、检测原理及方法、生物信息学分析等方面都存在较大差异，很难对不同产品和研究进行准确性比较，也难以建立统一的检测流程及评价指标。其次，NGS等新技术主要以实验室自建项目（laboratory developed test，LDT）的形式开展。目前国内外LDT管理的发展道路均不平坦，长期面临“一放就乱、一管就死”的困境，因此限制了新技术新项目的规范临床应用 ^{［ 20 , 21 ］} 。此外，缺乏临床实用性证据也是限制新项目临床应用的重要因素。以液体活检为例，大部分研究着重评估新技术的分析有效性和临床有效性，但缺乏评估是否给患者结局带来获益的临床实用性证据 ^{［ 22 ］} 。然而，开展此类临床研究的门槛往往较高，需要投入大量的资源、时间，还要面临研究失败的风险。以肿瘤早筛产品为例，通常需要纳入上万名受试者，耗时十年以上，才能证明新型早筛技术是否真正降低了人群特定肿瘤的死亡率 ^{［ 23 ］} 。

过去20多年，肿瘤分子诊断领域领域迎来了飞速发展，新技术不断迭代升级，为肿瘤精准诊疗持续输入新理念。展望未来，肿瘤分子诊断发展的方向需要兼顾创新与应用，如何将新技术合理合规地应用于临床是未来的重点关注方向。

1.传统与创新技术并驾齐驱：新技术的发展并不代表传统技术的淘汰，综合利用不同技术的优势，以最经济有效的方式解决临床问题才是根本。以数字PCR为例，尽管NGS逐渐成为肿瘤分子诊断的主流手段，但数字PCR并不会被完全取代，因其超高灵敏度及绝对定量的特点，未来在液体活检、微小残留病监测等方面仍会发挥重要作用 ^{［ 24 ］} 。同样的，NGS也不会因为三代测序的问世而失去应用价值，NGS不仅能满足临床基本需求，在技术成熟度、成本可控性、结果准确性方面仍远远高出三代测序。

2.人工智能助力多组学技术临床应用：多组学检测（基因组、转录组、蛋白组、代谢组等）纳入肿瘤常规诊疗是未来趋势。目前最有望实现多组学临床应用的领域是肿瘤早筛早诊，多款在研试剂盒均基于多组学分析技术，如CancerSEEK、GutSeer等 ^{［ 11 ］} 。在多组学时代，精准肿瘤学面临的最大挑战不是数据生成，而是对生成的多参数数据集进行有临床意义的解释。人工智能驱动的多组学分析不仅加深对肿瘤生物学的理解，还能挖掘新的肿瘤生物标志物与治疗靶点。尽管基于人工智能的多组学分析取得了长足的进步，但其在精准医疗中的应用仍面临诸多挑战，包括数据稀缺性、决策过程缺乏透明性以及模型缺乏通用性等 ^{［ 4 ， 17 ］} 。

3.临床决策支持工具提升分子诊断价值：随着测序技术的广泛应用，仅凭人工进行海量数据的解读是不现实的。临床决策支持工具（clinical decision support，CDS）将有助于克服结果解读的难题。CDS通过自动提取分析医院信息系统与实验室信息系统来源的患者数据，结合指南共识，利用算法和模型制定个体化的诊疗决策 ^{［ 25 ］} 。CDS将是提高肿瘤分子诊断利用率的有效工具。然而，如何有效提取患者信息将会是限制CDS应用的重要因素。目前大多数基因组测序检测结果都以文档的形式展现，不利于信息有效提取。因此，对基因测序等复杂检测结果的标准化、结构化呈现也是未来改进的方向之一。

肿瘤分子诊断的发展源于肿瘤治疗理念与技术的相互推动。检测技术的迭代升级以及液体活检的问世，都标志着肿瘤分子诊断的演进，也推动了肿瘤诊疗进入新时代，从简单的分子分型与用药指导，逐渐扩展至早期肿瘤的复发监测与早筛早诊。尽管新技术不断涌现，但诸多因素限制了其临床推广应用，包括：标准化问题、合规问题、缺乏临床实用性证据等。分子诊断技术的创新不会止步，如何合理、合规应用新技术是未来的重点关注方向。人工智能与临床决策支持工具将为精准肿瘤学提供更多可能性。