2025年7月，国家卫生健康委临床检验中心（NCCL）发布了2025年全国mNGS/tNGS分别下呼吸道与中枢神经系统病原体室间质评预研的启动通知。这是一年一度的mNGS/tNGS“国考”，也是mNGS与tNGS检测性能的权威试金石。既往没有参加国家临检中心“国考”，或此次没有拿到名额的实验室来说，在临床开展应用前，该如何进行mNGS的性能确认评估？让使用者（检验科）安心，让申请者（临床医生）放心，让受益者（患者）有信心。笔者结合国内外相关研究成果与专家共识内容，既往经验，以两期内容分享一些收获与心得。2020年11月，《中华传染病杂志》上发表的“中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识”的开篇指出：病原学诊断始终是感染性疾病诊断中最重要的环节，突显了明确病原学证据在感染性疾病诊疗中的重要性。mNGS能够直接检测临床标本，快速、广谱覆盖各类型病原体，满足临床明确感染病原体的迫切需求，才得以被广泛应用在感染相关科室。因此，mNGS性能确认应尽可能考虑到临床应用的各种情况，比如：（1）样本中存在的病原体能不能检出？ （2）样本中没有的病原体会不会假阳？ （3）样本复测之后结果是否一致？ （4）样本中微生物达到多少浓度才能检出？ （5）检出的序列数能量化病原体载量吗？ （6）血液蛋白或药物等会不会干扰检测结果？ （7）基因组相似高的近缘物种会不会报错？ （8）与既往明确病原体的临床样本，总体符合率如何？ 以上问题，依次评价指标分别是敏感性、特异性、重复性、最低检出限、稳健性、抗干扰性、交叉干扰确认与临床准确性评估。 mNGS性能确认，旨在确保实验室开展的mNGS检测项目，能够满足检测需求及临床明确病原学证据的要求，保证送检患者标本检测结果的准确性。参考盘应当接近于临床标本的理化性质与微生态或病原谱特征。基质的选择应当是优先考虑在实验室未来可能检测占优势的临床样本类型。自2014年新英格兰期刊报道首例mNGS临床应用病例以来，脑脊液（CSF）、血液（Blood）和肺泡灌洗液（BALF）无疑已是临床感染病原体检测中应用TOP3的标本类型。mNGS能够无偏移检测不同类型病原体，但实操中难以评估数万种微生物，因此建议针对性的评估临床重点关注的病原体。呼吸道感染、血流感染与中枢神经系统感染的病原体各有差异，且同一个病原体在不同身体部分的致病性也存在显著差异，那么建议选择与预期用途相关具有代表性的病原体。2019年4月，在Genome research期刊上发表了Charles Y. Chiu团队在中枢神经系统感染中mNGS性能确认的研究成果，以脑脊液样本为基质，设置了7种中枢神经系统感染代表性的病原体，涵盖所有病原体大类，分别是通过性能确认获得的各个病原体的LOD值（最低检出限）也显著优于传统病原学检测技术，突显mNGS能够大大的提升对临床感染病原体检测的成功率。2019年4月，在Nature microbiology期刊上发表了Karius团队在血流感染中mNGS性能确认的研究成果，评估了以血浆为基质的13种血流感染代表性的病原体，分别是烟曲霉、百日咳鲍特菌、隐孢子虫、大肠埃希菌、腺病毒、利士曼原虫、结核分枝杆菌、恶性疟原虫、铜绿假单胞菌、福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌。
（1）该方案中，侧重考虑是血流感染，并没有设置RNA病毒。这点也再次提示应当选择跟预期用途相关的病原体，血流感染中RNA病毒相对少见（也不是完全没有，比如登革热病毒）；（2）方案中物种设置考虑了病原体种类、血流感染代表性的病原体、基因组大小、基因组GC含量、是否定植菌/污染菌等维度之外，还考虑到了同属不同种的近缘物种，如金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌，与基因组相似的物种，如大肠埃希菌与福氏志贺菌，用于评估基因组相似物种的分析特异性，及识别基因组相似物种共感染。（3）在实际操作中，纳入定植菌、环境或试剂可能污染菌对于性能验证本身会带来一定的挑战，需要设置明确的阴性质控及报出阈值，建立污染过滤规则和解释结果，很重要。2022年9月，发表在《中华检验医学杂志》题为“ 病原宏基因组高通量测序性能确认方案”的专家共识中，北京协和医院检验科研究团队以阴性BALF为基质，按照DNA流程与RNA流程分别进行参考盘设置，涵盖17种呼吸道感染代表性的病原体 ① 细菌：鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌（与金葡又成对出现）；（2）RNA流程参考品物种，包含4种：甲型流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和冠状病毒。这里大家会发现少了寄生虫这个类别，我猜测应该有多方面的考量因素：（2）相较于其他类别，寄生虫也更难定量，上述2019年4月在Genome research期刊中发表的结果中，寄生虫的定量organisms/mL为单位；（3）相较于其他大类的病原体，寄生虫的发病率也更低一些。此外，mNGS性能确认还涉及到临床样本符合率的评估 不管是标本还是病原体类型的选择，整体上与参考盘制备中的逻辑是类似，不同的是没有了参考盘多种硬性的评价指标，及参考品采购与制备周期的限制，因此在标本类型与数量、病原体类型的选择上更具灵活性。 mNGS性能确认的执行过程，是“实操性”、“时效性”与“检测成本”的平衡，建议可以采用参考盘与临床标本之间相辅相成，让整个性能确认维度更全面。 （1）参考盘选择一种基质，临床标本可以选择多种类型，确认mNGS在不同样本类型的性能； （2）参考盘难以获取的物种，可以选择对应明确阳性的临床标本，如刚才提到的寄生虫。此外临床标本可以选择单菌检出（细菌、真菌、病毒或寄生虫），也可以选择多菌混合检出（比如细菌与细菌、细菌与真菌、真菌与病毒等），应尽可能响应到临床应用的各种情况。
回顾中枢神经系统感染、血流感染与呼吸道感染三个方向的性能确认研究成果，性能确认参考盘制备中需要考虑两个维度：基质的选择与病原体物种的设置。基质的选择，根据未来临床应用中的实际需求，选择匹配的基质类型，加之临床标本进行夯实与补充。（2）脑脊液是无菌体液样本，受到微生态菌群的干扰小一些（3）从获取难易程度上来说，血液似乎是更好的选择。病原体物种的设置，建议选择呼吸、中枢、血液感染等预期用途相关病原体。（4）基因组相似的近缘物种，评估了基因组相似物种在共感染期间的交叉反应程度
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