新疆和田玉，羊脂白玉级无事牌。牌型方圆有致，脂粉浑厚，不事雕琢，谓之无事。吉祥纳福，收藏与把玩珍品。 打油诗几句，诸君子助兴。 流逝秋光每日新，郊原棘荔不均匀。 蜻蜓恰自傍筠竹，红叶无由缀莽榛。 长想曲江兼喜色，何嗟粉蝶独嫌人。 芊芊荞麦巢黄鹤，去去来来鹪鹩频。 籽料说，籽料最近在德观资本的微信公众号里偶然读到一篇文章，里面论述了高通量基因测序（NGS）技术平台的历史与未来走向，观点独到，籽料很仔细地看了一遍。 老福说，你是和老福一起卖石头的，居然还关心高新科技发展趋势，殊为难得。 这篇文章是老福几个月前写的。科技发展日新月异，这才过去了几个月，情况又有变化。老福觉得，有必要对这篇文章稍作打磨，以适应新的形势发展。 籽料说，籽料也发现了，文章里包含有一些老福原创的成果和数据，还没有在其他作者的文章中看到。善哉。 老福：以下是这篇文章的主要内容，删除了一部分细节描述。其中蓝字部分是图例；红字部分，是老福的原创观点。 一、NGS能均衡地满足临床和科研对于基因检测的多方面高标准需求 高通量基因测序（next generation sequencing，NGS，也叫二代测序）能够均衡地满足临床检验、新药开发和基础研究对于基因检测的多方面、高标准需求，是确定基因变异检测技术平台的上佳选择。无论临床检验、新药开发还是基础研究，都要求基因检测平台在可同时检测的位点数量与变异种类、设备与试剂的成本、检测周期与操作的便捷程度、准确性和灵敏度的高低等方面具有优势。尽管定量PCR、数字PCR、Sanger测序（也叫一代测序）、三代测序等基因检测技术各有优势（图1），也都被大量运用，但是它们优点与缺点并存。综合比较下来，NGS平台性能均衡，是其中的首选，必将在较长时间内成为临床和科研基因检测的主流。
图1 由于意义重大，基因检测技术获得了充分的发展，成熟且性能优异的技术路线数量众多。老福对现有的基因检测技术进行了梳理，把它们归纳为分子杂交、基因扩增（PCR）和基因测序三大类，并参照行业标准，把这些技术各自划分为三代，原创性地揭示了基因检测技术的脉络全貌。其中又以基因测序为集大成者，发展更为充分，实际上历经了四代的变革。为简便起见，把原代的平板胶测序（非荧光，放射性标记）与一代毛细管测序（荧光）合并为一代。 在过去的15到20年间，NGS的发展使得我们能够更快速、更便宜、更准确地同时对更多的DNA位点进行大规模测序。虽然Illumina测序仪仍然占据主导地位，其他NGS供应商正蓄力前行，为测序机制、读长、运行时间、易用性和可扩展性提供重要的替代选项。NGS技术平台的开发始终是高度活跃并卓有成效的领域，至今仍然有大量资本持续投入。自大约2006年NGS兴起至今，国际上出现了两波NGS平台集中上市的热潮，而且近几年国内开发上市的机型甚至比国外的还要多。整体上，呈现出新兴平台不断涌现，经典平台持续发展这样两个特点。 今年以来发生的行业大事件，莫过于商务部把Illumina公司列入不可靠实体清单。Illumina测序平台的市场占有率全球第一，并且大幅领先于同行，猝然面临这一停车式变故，其所释放出来的巨大市场空间，将为国内相关行业迸发生机提供新的契机。 如今虽然形势一直在持续发生变化，但是对于每一家用户来说，平台一旦切换，由于SOP、质量管理体系、审计、库存等各方面因素，再要切换回去是比较困难的。这就是说，在新形势下，NGS作为基因检测主流平台的地位没有改变，但是NGS平台在中国市场上的优势品牌将会发生改变。 二、出现过两波NGS平台开发热潮 在差不多持续了20年的时间窗口内，国际上涌现过两波NGS平台开发热潮。第一波，以Roche (454平台)、Illumina (Solexa平台)和Thermo (SOLiD和Ion两个平台)三家为代表；第二波，以Element (Aviti平台)、PacBio (Onso平台)和Ultima (UG100平台)三家为代表。 在第一波的经典NGS平台里，Illumina和Thermo最终胜出，Roche早年间关停了454平台。Illumina的技术简洁明了，运行稳定，先后推出了高通量、中通量、低通量多个系列，占据第一。在被列入不可靠实体清单之后，有可能使得所有这一切在中国境内付诸东流。名家Thermo出品的Ion系列半导体测序平台，数据准确度高，检测速度快，特别是在基于多重扩增技术原理的肿瘤基因检测panel产品开发上，具有巨大优势。多年来Thermo稳打稳扎，在当前的新形势下，更是展现了潜力。 在第二波的新兴NGS平台里，Element的Aviti性能优良，表现突出。PacBio Onso平台的实际表现本来还有待于观察，结果最近有消息说，PacBio终止了对于Onso的投入。至于Ultima，则已经沉寂了一段时间。 这种三家竞争、两家胜出的现象，在基因检测平台开发的领域里反复出现，可能不完全是巧合。它在一定程度上反映了市场容量可以承载的限度，体现了投资与创业成功所需要面对的竞争情况。 国内这方面的进展也很火热。在基因检测平台开发这一领域，我们踏准了节奏，跟上了国际发展的潮流。不仅华大基因，我国科学家近几年又陆续发布了多款新型NGS测序平台，属于第二波NGS平台开发浪潮的组成部分。 三、NGS平台相互竞争的关键性能指标 NGS平台提供商致力于持续降低测序成本，提高平台的易用性和可扩展性，目标是使NGS技术能够更容易地运用于更多的实验室，整合更多的研究领域包括蛋白组学、多维空间组学、单细胞原位测序等，支持更多的应用。 3.1 成本 由于短读长测序（即NGS）的发展时间较长，该技术更为普遍，而且通常更便宜。近年来NGS的成本持续下降。以Illumina为例，其官方数据显示，Illumina致力于降低测序成本。NovaSeq 6000的每Gb价格低于5美元，新推出的NovaSeq X每Gb价格低于2美元。与Illumina早期的第一款平台相比，测序成本分别降低了500倍和1500倍。但无论使用哪种平台，测序成本在很大程度上取决于各个项目、每个样本的目标读取数量以及NGS使用情况。 除了测序平台生产商持续投入，开展研发，提高仪器设备的性能之外，作为用户的操作者，在应用端也能为测序成本的降低作出显著贡献。作者实验室曾经对Aviti的操作流程进行了系统的优化，使其单次运行的数据产量获得了大幅度提升（图2），从而把台式机的测序成本降低到了工厂级测序平台的水平，使得测序成本进一步获得了显著的下降。
图2 老福实验室对Element Aviti平台的操作流程进行了系统性地优化，大幅度提高了单次运行的数据产量，显著降低了基因检测成本。横坐标为测序芯片的编号，纵坐标为每张芯片的数据产量(Gb)，提高了约2倍。 3.2 易用性和可扩展性 与早期的测序仪相比，一些较新的型号强调易用性和可扩展性。例如，为了支持小型实验室和医院内部使用NGS，Thermo Fisher研发了Genexus系统，可自动执行从样本提取到报告的整个NGS工作流程，操作时间只需要20分钟。Genexus系统由用于核酸提取和定量的纯化系统和在一天内自动进行文库制备、测序和分析的集成测序仪组成。Genexus系统为新接触NGS的实验室提供了简单、快速、可扩展的解决方案，以经济高效的方式自行进行测序。 3.3 新兴NGS平台聚焦的性能亮点 为了与经典NGS平台形成差异化，新兴NGS平台普遍从以下三个方面着手发力，以构建其产品的性能亮点： （1）提高下机数据的质检标准，把QV阈值从Q30提高到Q40至Q50。 （2）降低测序成本。 （3）解决分子疤痕问题。 三者之中，比较硬核的技术改进是对于分子疤痕问题的攻关。在经典NGS平台中，DNA链延伸（碱基掺入）与信号检测是在同一个步骤里完成的。新兴NGS平台普遍把这两个步骤分开，分成两个独立的步骤分别进行，从而降低分子疤痕的不利影响。可以看出，这种技术路线，既有有利的一面，也有不利的一面，那就是增加了实验步骤，对检测平台引入了更多的复杂度，这也会导至一些不利影响。 与新兴NGS平台相比，ThermoFisher出品的Ion系列作为成熟的基因检测平台，经受了大量真实世界临床样本的验证，其性能表现满足CLIA、CAP等高级别实验室质量管理规范的要求。当然，随着时间的发展，老福预计新兴NGS平台也将逐步展现各自的性能优势，通过实际样本来证明自己。 |
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