为什么CRISPR是未来核酸POCT的核心技术方向？

在病原体检测技术发展过程中，qPCR及dPCR提升了检测灵敏度，解决了检测准确性的问题。NGS提升了检测的通量与靶标范围，解决了检测全面性与检测效率的问题。

在以上基础检测需求得以满足的条件下，快速、简便成为新的检测需求。核酸即时检测（POCT）产品应运而生，成为新的竞争方向。

参考《病原体核酸快速检测临床规范化应用专家共识》，病原核酸POCT产品应具备如下特征：

• 一体化（预处理、提取及扩增等环节整合在同一设备内完成）

• 全封闭（无需开盖操作）

• 速度快（可在40分钟以内完成）

• 小型化（体积小、可便携）

在此要求下，qPCR技术、LAMP及RPA等恒温扩增技术成为POCT中的主要技术策略。但以上技术在实际应用中仍面临多种问题。

1、qPCR

传统qPCR检测是病原核酸检测中的金标准，但一直存在检测时间长、设备复杂的问题。

近年来，随着qPCR仪的微型化和反应体系的优化，基于qPCR的检测产品得以逐步应用于POCT场景。

除外设备本身高成本的限制外，部分微型化qPCR设备可能面临准确性和稳定性挑战，并且仍难以摆脱核酸气溶胶污染的风险。

2、恒温扩增技术

以LAMP、RPA等为代表的恒温扩增技术因检测时无需变温，具备快速、高效的优点，成为POCT产品的核心技术方向。

但实际应用中，恒温扩增检测产品面临着引物设计复杂、检测稳定性差、特异性低以及易产生气溶胶污染等问题，一定程度上限制了其在POCT中的广泛应用。

CRISPR系统是细菌抵抗病毒入侵的“分子免疫武器”。当这一系统与Cas蛋白协同作用时，可在gRNA引导下精准识别并切割特定核酸序列。Cas12、Cas13等蛋白在识别靶标核酸后会被激活出“反式切割”活性，无差别切割周围游离的核酸报告探针，从而实现信号放大作用。

CRISPR诊断技术具备支持恒温检测、设备依赖低、检测分辨率及特异度高的优点，与传统POCT技术相结合后，可有效解决POCT中的已有问题，将是未来POCT中的核心技术。

1、与恒温扩增技术结合，解决检测性能的问题

恒温扩增 + CRISPR诊断技术策略可通过恒温扩增对检测信号进行第一轮放大，扩增后的核酸通过Cas12a等Cas蛋白反式切割后实现第二轮信号放大，大大提高检测灵敏度，可实现单分子检测。

同时，CRISPR诊断技术高特异性的特点有效弥补了恒温扩增技术特异度低的缺点。

两种技术结合形成优势互补，结合侧向流层析技术，可开发出远超胶体金技术的高灵敏检测试纸条。将是未来临床POCT以及家用自测产品的核心策略。

2、免核酸扩增检测技术，解决气溶胶污染问题

恒温扩增 + CRISPR诊断技术的检测策略虽然提高了检测灵敏度，但依然存在耗时长、气溶胶污染风险及假阳性等问题。CRISPR诊断技术本身无需扩增，因此，免核酸扩增的CRISPR检测技术成为新的关注方向。

免核酸扩增CRISPR分子诊断技术通过四种核心策略提升灵敏度：(1) CRISPR/Cas系统优化；(2) 利用微滴微流控技术将反应体系分割，实现单分子检测；(3) 结合电化学生物传感器提高检测灵敏度；(4) 通过级联反应实现指数级信号增强。

这些策略在保持高特异性的同时，将检测限降至接近阿摩尔水平（aM），大大降低了气溶胶污染，适用于便携式设备及即时检测。

3、单碱基检测能力，弥补了扩增技术在突变检测中的局限性

从技术原理上看，qPCR在单碱基突变检测中的灵敏度和特异度存在显著局限：

• 灵敏度受制于背景信号干扰，对低突变丰度样本易漏检；

• 因引物或探针无法完全区分单个碱基差异，易引发非特异性扩增，降低检测特异度。

其他恒温扩增方法也难以摆脱类似问题的限制。

因此，基于单一扩增原理的POCT产品在应用于病原体耐药突变检测、肿瘤伴随诊断等单碱基突变检测场景时存在局限。

CRISPR诊断技术本身的高分辨率与高特异性，正为检测单碱基突变而生。

我国科学家开发了名为SPEAR的新型癌症突变检测方法，该方法整合了NEAR等温扩增与CRISPR技术，可在30分钟内完成血液样本分析，通过单管反应实现对癌症相关多个单核苷酸多态性（SNP）的超灵敏检测。在灵敏度上优于一代测序，与二代测序相当。这为肿瘤伴随诊断、耐药基因突变检测提供了更加快速的POCT产品开发路径。[4]

4、支持多靶标检测，弥补了恒温扩增技术多靶标检测中的限制

恒温扩增技术在多靶标检测中存在困难。单管4重及以上病原POCT仍需依赖多重PCR技术。

而早在2018年，张锋团队即在SHERLOCK分子诊断平台基础上，利用四种Cas蛋白针对的信号核酸序列不同的特点，完成了单管四重检测，检测限可达amol级别。

2022年开发的微流控组合阵列反应核酸多重评估系统（mCARMEN），结合CRISPR的诊断技术及微流控技术，可实现同时检测21种病毒。可在8小时内平行检测300至550例临床标本，且除1种病毒外，检测性能均达到FDA检测标准。

此外，CRISPR系统已被改造用于检测非核酸物质，包括离子、无机小分子、有机化合物、蛋白质等。质谱、高效液相法、气相法等传统非核酸靶标检测方法均需依赖大型检测设备。CRISPR诊断系统便捷高敏的特征也将为非核酸物质的POCT提供新的思路。

总之，与qPCR技术相比，CRISPR诊断技术增加了检测的速度与便捷性。与恒温扩增技术相比，CRISPR诊断技术显著提高了检测性能。同时，CRISPR诊断技术本身低气溶胶污染、可检测单碱基突变、并具备多靶标检测和非核酸靶标检测能力。

诚然，CRISPR诊断技术也面临检测成本及脱靶效应等技术问题。但是，伴随着试剂价格的不断降低，以及CRISPR诊断方法的进一步优化。无论从检测性能还是产品易用性上看，CRISPR诊断技术都将是未来核酸POCT的核心技术方向。

参考文献：

[1]Zhang S, Xu D, Li F, Wang J. CRISPR-based non-nucleic acid detection. Trends Biotechnol. 2025 May 14:S0167-7799(25)00139-8.

[2]Li H, Xie Y, Chen F, Bai H, Xiu L, Zhou X, Guo X, Hu Q, Yin K. Amplification-free CRISPR/Cas detection technology: challenges, strategies, and perspectives. Chem Soc Rev. 2023 Jan 3;52(1):361-382.

[3]Welch NL et al,Multiplexed CRISPR-based microfluidic platform for clinical testing of respiratory viruses and identification of SARS-CoV-2 variants. Nat Med. 2022 May;28(5):1083-1094. doi: 10.1038/s41591-022-01734-1. Epub 2022 Feb 7. Erratum in: Nat Med. 2024 Jan;30(1):307. 

[4]Bai L, Pang Y, Wang T, Wang S, Guo K, Xuan T, Zhang Z, Liu D, Qian F, Zheng Y, Jin G, Wang R. SPEAR: CRISPR-mediated ultrasensitive, specific and rapid one-pot detection strategy for cancer-related SNPs. Theranostics. 2025 Feb 18;15(8):3275-3288.