酶联免疫吸附测定（ELISA）进阶（2）：优化ELISA的12个技巧
2025-2-21 15:15|
编辑: 归去来兮|
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评论: 0|来源: 生物药笔记
摘要: ELISA因其简单性、特异性和成本效益而受到青睐。
本文部分内容来源于网络，仅进行翻译、编辑和整理，版权归原作者所有；本文仅作为知识分享和学习使用，不用做商业用途，如存在侵权请联系公众号删除。 一、前言 ELISA因其简单性、特异性和成本效益而受到青睐。适用于多种分析物的ELISA试剂盒可以在商业上购买，但这些试剂盒往往很昂贵。这导至许多实验室开发自己的检测方法，尤其是在预算有限或需要分析大量样品的情况下。尽管该技术整体易于使用，但为了设计稳健可靠的分析，仍需要考虑许多因素。以下是我查阅资料和结合自身经验整理的ELISA开发技巧，分享给大家，希望能有所帮助。二、优化ELISA的技巧（1~4）ELISA的类型由于ELISA的设计非常灵活，因此可以根据实验需求进行合适的format选择。最好使用最简单的ELISA格式，这样对成本控制更有利；但是同样的，还需要考虑特异性、干扰等问题。例如，如果是筛选合适的单抗，那么简单的直接或间接ELISA比较合适；如果是在复杂基质中特异性检测目标待测物时，则夹心ELISA是最佳选择。如果是检测一些分子量较小，同时关键试剂不好获得时，竞争ELISA则是更好的选择。如果有更进一步的需求，可以留言或者私信沟通交流，篇幅有限我就不在这里进行赘述。由聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的平底96孔板用于绝大多数ELISA分析。使用专为ELISA设计的板非常重要，因为它们的制造是为了保持一致性、最大限度地减少边缘效应并为数据收集提供最佳光学条件。最好选择值得信赖的厂家，或对于一些耗材提供商的产品进行产品性能确认，通过对同意样品标准化操作，然后比较批内和批间各个孔的信号差异，尽量控制到5%以下为最优。值得注意的是，一些酶法在催化底物时，产生的是荧光或者化学信号，这时候可能需要选择一些不透明的板，防止荧光透射到其它孔径中干扰检测。除了考虑到均一性等性能外，还要考虑板的包被载量和结合特性。包被载量主要取决于板材料和处理方式。一般厂家都会提供相应的参数，如果是大厂一般都不用担心载量问题，通常都会达到至少300ng IgG/cm2。如果选择一些普通厂家则需要了解相关参数或进行试验验证。确保不是因为载量问题导至实验参数不理想。下图为某厂家的ELISA板载量参数。关于结合特性，可能是在包被一些特殊蛋白时需考量。如：因通常ELISA包被是利用疏水作用等物理特性包被的，当需要包被的蛋白太小且大部分氨基酸都是亲水氨基酸时，常规的包被方式就不合适，包被条件调整的策略在下一条讲，这时候其实也可以更管合适的ELISA板，如处理后的亲水表面ELISA板。包被主要要考虑的是包被液、温度、浓度、时间等条件。常见的包被液有碳酸盐缓冲液（CBS）和磷酸盐缓冲液（PBS）。CBS pH值在9.6左右，呈弱碱性；PBS pH值在7.4左右，偏中性。包被的蛋白可能会因为一些氨基酸、等电点的原因，导至在碱性条件下包被不理想，可以尝试不同类型的包被液。包被温度一般有4℃、室温、37℃等条件。一般包被温度和包被时间相配合。一般包被4℃和室温都是过夜包被，而37℃通常2小时左右就可以了。但是一般4℃和室温过夜包被更加稳定充分，且对蛋白保护较好，37℃可能一些蛋白不太稳定，包被均一性可能也有些不确定，在条件允许下，推荐过夜包被。包被浓度的选择一般和板载量和测量format的适配程度相关，一般通过棋盘进行确认和选择，将会在棋盘条目进行阐述。值得注意的是，一些小蛋白如多肽很难包被，这是可选择对其进行蛋白偶联，常见的偶联物有BSA、KLH、OVA等。封闭液的选择关乎到ELISA的整体性能，封闭的目的是包被完成后，将空白位置填补上，防止后续步骤中的任何非目标结合的蛋白结合到板子上，造成干扰和背景信号异常。通常的封闭液都是一些无关蛋白，如BSA、动物血清、脱脂奶粉、酪蛋白等。目前也有一些针对特殊需求的非蛋白封闭剂。当你在进行ELISA检测无论如何进行试剂浓度调整，发现背景信号都很异常时，可能就是封闭液选择不对，就需要分析可能的原因。如封闭液BSA较大，在一些特殊条件下可能不能完全填补非特异结合的无关蛋白的结合位置，这时候就需要更换成酪蛋白等较小的封闭试剂等。封闭过程如何防止非特异性结合三、优化ELISA的技巧（5~8）洗涤步骤减少了未结合抗体引起的背景信号，从而提高了分析的信噪比。每个步骤之间的洗涤确保仅保留特定的结合抗体，从而在最后一步中产生信号。洗涤不充分会导至差异和高背景，从而导至不良结果。一般洗涤试剂为PBST。影响洗涤步骤的参数包括洗涤量、时间、次数、操作规范等。一般洗涤最好高于孔的包被体积。体积太小会留下部分检测表面未清洗，并强烈增加背景。所有孔中的洗涤体积必须相等。常用的包被体积为100~200μl。所以建议洗涤量使用300 μl及以上。通常，洗涤循环次数越多，背景越低。但是，过多的洗涤次数会洗掉一部分目标结合物从而降低信号强度。一个好的办法是，在用抗体或抗原孵育每个步骤后，重复洗涤步骤三次。部分ELISA中，可能洗涤液在孔中的停留时间会让不同孔中的结合和洗涤情况发生改变。当发现出现类似情况是，可以适当增加洗涤后的停留时间，让各个孔趋于一致。通常可选的静止时间为1~5min。部分有条件的实验室可能会选择洗板机，一方面可以加快实验，增加处理样品量，同时也让洗涤步骤规范，检查孔间差异。不过目前市售的洗板机成本较高，通常都在4位数起步。如人工洗涤，则尽量保证操作的规范性和一致性。ELISA实验的每一步试剂并不是越多越好，浓度不是越大越好。通常情况都会有个最适的浓度配比，无论是包被还是检测。当抗体使用过多时，由于非特异性结合，背景噪音会很高。如果浓度过低，分析将失去灵敏度。所以可以适当的增加棋盘法的摸索，确定最佳的浓度配比，以达到较低的背景信号和最适的信噪比。棋盘测试的方法是对用于包被的蛋白、样品和二抗（加上任何其他抗体，例如在设计夹心 ELISA时）进行一系列连续稀释，并将它们相互测试，每种情况都有阴性对照。当待测样本是复杂基质如血清时，可能存在一定程度的基质干扰，为减小这种干扰，通常情况下需要摸索最小稀释倍数（MRD）。当稀释大于最小稀释倍数时，通常都能准确测量，因待测浓度过低时，可能无法在无干扰情况下检测样本时，需通过实验证明干扰程度，以判断样本检测的偏差。同时，稀释时为保证样本稀释的准确，通常将连续稀释和吸取体积控制在较可控的范围内。通常吸取体积要根据不同实验室移液器情况制定，保证操作人员吸取准确。通常要稀释高倍数时，建议增加中间步骤。如1:100稀释时，可拆分为两次1:10，以增加准确度。同时，在不同的稀释液体系下，可能待测物的结合情况会发生变化，通常情况下的稀释液可使用1%BSA，但在一些特定情况下，可能有一些干扰结合的情况，这时候就可以添加一些特殊试剂，如一些非特异结合较强时，可在稀释液中添加tween-20。虽然在目标待测物的多种抗体可用的情况下，最好对每种抗体进行测试。选择抗体时需要考虑许多因素。多克隆抗体的靶标范围更广，通常更便宜，但可能会降低检测的特异性。单克隆抗体通常更昂贵，但更具特异性。通常，测试这一点的方法是尝试来自不同制造商的一系列抗体。在选择用于夹心 ELISA 的对时，这种选择变得更加重要，因为抗体必须彼此识别不同的表位。四、优化ELISA的技巧（9~12） 无论是一些非关键试剂（如BSA），还是一些关键试剂，如抗体，都可能随着实验周期问题发生批次的变化。批次的变化可能会改变性能。如BSA的批次变化可能改变背景信号或信噪比，抗体的批次变化可能改变灵敏度。所以在整个实验周期内，要考虑清楚是否存在批次变化，以及评估批次变化后对实验的影响。ELISA是用过如HRP与TMB配合的方式进行显色，检测OD值，其显色与时间相关。所以要对自己的ELISA方法显色时间与OD值的关系有明确的认知，如果加入TMB后的颜色与平常时差异不大，则可按照过往经验固定一个显色时间。如果与平时存在明确变化，如加入TMB时颜色迅速变化，则可能需要提前很多进行终止，否则会超出酶标仪的检测上限（通常OD值为4.0）。11.保持孔间的一致性可能一些人在实验时发现同一个样品不同孔之间的差异较大，这可能是没有做到孔间一致的原因，如加抗体、洗板等步骤中引入的孔间差异。通常情况下可以考虑使用多通道移液器和洗板机以提供更一致、更快速的结果，以及更高的通量。确保ELISA中使用的所有移液器都经过定期正确校准非常重要。此外，观察移液器吸取和打出时液面的一致也是一个很好的方法，当使用多通道移液器时，这一点尤其重要，因为有时末端行的吸头并不总是完全连接到移液器上。12.建立标准化的操作程序标准化经常被忽视，考虑到板/实验之间的变化，建立标准化的操作可以最大限度地减少操作对整体结果的影响。在使用血清作为分析物的实验之间进行归一化的一种简单方法是将每个血清样品的结果与阴性血清对照的结果进行比较（如信噪比）。通过这样做，可以最大限度地减少来自外部因素（如室温和显影时间）的任何变化。通过将测试样品的OD除以对照的OD。虽然这不是绝对定量，但通常不需要绝对数字，但仍然可以获得一组可靠的结果，并且可以将样品相互比较。五、总结 ELISA实验在不同的应用场景下，需要考量的点都不太一致，以上总结为通常情况。如果在实验具体应用中有哪些困惑点，可在评论或私信中交流，共同进步！
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