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一、前言
本文内容为PCR技术的整理笔记PCR的定义、原理、酶、步骤、类型、用途等。因PCR进阶PDF《How to Become a PCR PRO》有96页，篇幅巨大，本人精力有限，对其感兴趣的朋友可以留言，我将原版发给有需求的朋友。下图是该PDF的目录以供参考。
二、什么是PCR？聚合酶链反应（PCR）是一种核酸扩增技术，用于在体外酶促扩增DNA或RNA。这是一个与温度相关的酶促过程，其中DNA的特定目标区域或整个DNA被复制，以快速制造数百万个目标DNA或DNA片段的拷贝。它也被称为“分子影印”。1983年，美国生物化学家Kary Mullis在深夜开车回家时，一闪而过的灵感突然袭来。他在收据的背面写下了这个想法，这个想法最终使他在1993年获得了诺贝尔化学奖。这个概念很简单：在实验室试管中复制细胞中发生的 DNA 复制过程。结果是一样的：在现有DNA链的基础上生成新的互补DNA（cDNA）链。Mullis使用Sanger的DNA测序基础作为他的新技术的起点。他意识到DNA聚合酶的重复使用会触发链式反应，导至特定DNA片段的扩增。1976年，他发现了一种热稳定的DNA聚合酶Taq，该酶是从温泉中发现的Thermus aquaticus细菌中分离出来的，为他的想法奠定了基础。Taq DNA聚合酶的最佳温度为72 °C，可长时间暴露在高达96 °C的温度下存活，这意味着它可以耐受多个变性循环。在发现Taq聚合酶之前，分子生物学家已经在尝试优化环状DNA扩增方案，但他们需要在每个循环中添加新鲜的聚合酶，因为该酶无法承受DNA变性所需的高温。拥有热稳定酶意味着他们可以多次重复扩增过程，而无需在每个循环中使用新的聚合酶，从而使整个过程可扩展、更高效且耗时更少。1985年，《科学》杂志首次描述了这种使用Taq聚合酶的聚合酶链式反应（PCR）。1993年，第一个FDA批准的PCR试剂盒上市。从那时起，PCR得到了稳步和系统的改进。它已成为游戏规则的改变者从法医证据分析和诊断，到疾病监测和基因工程，无所不包。毫无疑问，它被认为是 20 世纪最重要的科学进步之一。二、标准 PCR 实验概述 PCR用于从称为模板DNA的复杂起始材料混合物中扩增特异性DNA片段。样品制备和纯化方案取决于起始材料，包括样品基质和目标DNA的可及性。通常，需要最少的DNA纯化，并且某些技术（如直接PCR或免提取PCR）不需要预纯化DNA或RNA。然而，PCR确实需要了解待扩增DNA片段两侧的DNA序列信息（称为靶DNA）。从实用的角度来看，PCR实验相对简单，可以在几个小时内完成。一般来说，PCR反应需要五种关键试剂：待扩增的DNA：也称为PCR模板或模板DNA。 该DNA可以是任何来源，例如基因组DNA （gDNA）、cDNA 和质粒DNA。DNA聚合酶：所有PCR反应都需要一种可在高温下工作的DNA聚合酶。Taq聚合酶是一种常用的聚合酶，可在70 °C下以60个碱基/秒的速率掺入核苷酸，并可扩增长达5kb的模板，使其适用于无特殊要求的标准PCR。新一代聚合酶正在被设计以提高反应性能。例如，有些样品被设计为仅在高温下激活，以减少反应开始时的非特异性扩增。其他方法则包含“校对”功能，例如，当扩增序列与模板序列完全匹配至关重要时（例如在克隆期间），该功能非常重要。引物：DNA聚合酶需要一个短序列的核苷酸来指示它们需要开始扩增的位置。在PCR中，这些序列称为引物，是单链DNA的短片段（大约15-30个碱基）。在设计PCR实验时，研究人员确定要扩增的DNA区域并设计一对引物，一个在正向链上，一个在反向链上，专门位于目标区域的两侧。引物设计是PCR实验的关键组成部分，应谨慎进行。必须选择靶向目标独特 DNA的引物序列，避免与相似序列结合的可能性。它们应该具有相似的熔融温度，因为两根链的退火步骤同时发生。与腺嘌呤 （A） 或胸腺嘧啶 （T） 相比，鸟嘌呤 （G） 或胞嘧啶 （C） 碱基的百分比会影响引物的熔解温度，GC含量越高，熔解温度越高。调整引物长度有助于在匹配引物对时补偿这一点。避免使用容易形成二级结构或引物二聚体的序列也很重要，因为这会降低PCR效率。许多免费的在线工具可用于帮助进行引物设计。脱氧核苷酸三磷酸 （dNTP）：这些是合成新DNA链的组成部分，包括四种碱性DNA核苷酸（dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP）。dNTP通常以等摩尔量添加到PCR反应中，以实现最佳碱基掺入。PCR缓冲液：PCR缓冲液确保在整个PCR反应过程中保持最佳条件。PCR缓冲液的主要成分包括氯化镁（MgCl2）、tris-HCl和氯化钾（KCl）。MgCl2作为DNA聚合酶的辅因子，而 tris-HCl和KCl在反应过程中保持稳定的pH值。通过混合上述试剂并将试管放入热循环仪中，在单个试管中进行PCR反应。PCR扩增由三组定义的时间和温度组成，称为步骤：变性、退火和延伸。单个 PCR 循环的步骤这些步骤中的每一个称为循环，重复 30-40 次， 在每个循环中使 DNA 量增加一倍并获得扩增。PCR 扩增 DNA 分子的不同阶段和周期。PCR的第一步称为变性，将模板DNA加热到95 °C几秒钟，随着它们之间的氢键迅速断裂，将两条DNA链分开。然后将反应混合物冷却30秒至1分钟。退火温度通常为50-65°C，但是，确切的最佳温度取决于引物的长度和序列。它必须用每组新的引物进行仔细优化。在此温度下，两条DNA链可以重新连接，但大多数不会，因为混合物中含有大量过量的引物，这些引物在特定的互补位置与模板DNA结合或退火。退火步骤完成后，模板DNA和引物之间将形成氢键。此时，聚合酶已准备好扩展DNA序列。然后将温度升高到混合物中存在的DNA聚合酶的理想工作温度，通常在72°C左右，在Taq的情况下为74 °C。DNA聚合酶附着在每个引物的一端并合成新的DNA链，与模板DNA互补。现在我们有四条 DNA链，而不是一开始存在的两条。温度升高到94 °C，双链DNA分子-包括“原始”分子和新合成的分子-再次变性成单链。这开始了变性-退火-延伸的第二个循环。在第二个周期结束时，有8个单链DNA分子。通过重复循环 30次，开始时存在的双链DNA分子被转化为超过1.3亿个新的双链分子，每个分子都是由两个引物的退火位点描绘的起始分子区域的副本。为了确定扩增是否成功，可以使用凝胶电泳观察PCR产物，指示扩增子的存在/不存在、大小和近似丰度。根据应用和研究问题，这可能是实验的终点，例如，如果确定基因是否存在。否则，PCR产物可能只是更复杂的下游研究（如测序和克隆）的起点。
由于其多功能性，PCR技术近年来不断发展，导至了几种不同类型的PCR技术的发展。最有用的发展之一是qPCR。顾名思义，qPCR是一种定量技术，可以实时监测扩增过程并在制备PCR产物时对其进行检测。它可用于确定目标DNA的起始浓度，在许多情况下无需凝胶电泳。 这要归功于非特异性荧光嵌入染料，例如SYBR® Green，当与双链DNA结合时会发出荧光，或者DNA寡核苷酸序列特异性荧光探针，例如水解 （TaqMan） 探针和分子信标.探针与扩增子内的DNA靶序列特异性结合，并利用Förster共振能量转移 （FRET） 的原理，通过一端的荧光分子和另一端的淬灭基团的偶联产生荧光。对于荧光染料和探针，随着目标 DNA拷贝数的增加，荧光水平成比例增加，从而可以参考包含已知拷贝数的标准品对扩增进行实时定量。qPCR 使用配备荧光检测系统的专用热循环仪，在扩增发生时监测荧光信号。用于定量未知样品中拷贝数的 qPCR 扩增曲线和标准曲线示例逆转录（RT）-PCR和RT-qPCR是两种常用的PCR变体，可在临床和研究环境中对病毒RNA 进行基因转录分析和定量。RT是从单链模板RNA制备cDNA的过程。因此也称为第一链cDNA合成。RT-PCR的第一步是在RNA模板和DNA寡核苷酸引物之间合成DNA/RNA杂交体。催化该反应的逆转录酶具有 RNase活性，然后降解杂交体的RNA部分。随后，通过逆转录酶的DNA聚合酶活性合成单链 DNA分子。高纯度和高质量的起始RNA对于成功的RT-PCR至关重要。RT-PCR可以按照两种方法进行：一步法RT-PCR和两步法RT-PCR。在第一种情况下，RT反应和PCR反应发生在同一个试管中，而在两步RT-PCR中，两个反应是分开并按顺序进行的。上述逆转录通常也是qPCR的第一步，定量生物样品（RNA转录本或来自病毒RNA基因组）中的RNA。与RT-PCR一样，通过RT-qPCR定量RNA有两种方法：一步法RT-qPCR和两步法RT-qPCR。在这两种情况下，RNA首先被逆转录成cDNA，用作qPCR扩增的模板。在两步法中，逆转录和qPCR扩增作为两个单独的实验依次进行。在一步法中，RT和qPCR在同一管中进行。数字PCR（dPCR）和数字液滴PCR（ddPCR）数字PCR（dPCR）是原始PCR方案的另一种改编版本。与qPCR一样，dPCR技术使用DNA 聚合酶，使用引物组和探针从复杂样品中扩增目标DNA。然而，主要区别在于PCR反应的分配和最后的数据采集。dPCR和ddPCR基于有限稀释的概念。PCR反应被分成大量纳升大小的子反应（分区）。在每个液滴中进行PCR扩增。PCR后，用泊松统计分析每个液滴，以确定原始样品中PCR阳性液滴的百分比。某些分区可能包含目标的一个或多个副本，而其他分区可能不包含目标序列。因此，分区分为正（检测到目标）或负（未检测到目标），从而为数字输出格式提供基础。ddPCR是2011年推出的一项新技术。ddPCR利用水油乳剂形成分隔模板DNA分子的分区。液滴基本上用作进行PC反应的单个试管。这项技术被用于创建敏感的SARS-CoV-2测试。最近开发的具有微通道和微室的微流体处理系统为一系列实际应用铺平了道路，包括在微流体芯片上通过PCR扩增DNA。在芯片上进行的PCR受益于微流体技术在速度、灵敏度和低试剂消耗方面的优势。这些特性使微流体PCR特别适用于即时检测，例如诊断应用。从实用的角度来看，样品流经微流体通道，反复通过反映PCR不同步骤的三个温度区。10μL样品只需90秒即可进行20个PCR 循环。然后可以轻松地在芯片外进行后续分析。不同的PCR方法都有优点和缺点，这些优点和缺点会影响它们适合的应用。下表总结了这些内容。不同PCR方法的主要优缺点PCR已成为现代分子生物学中不可或缺的工具，并彻底改变了科学研究。该技术还向分子生物学领域以外的人开放了对细胞和分子过程的研究，因此也得到了许多学科科学家的帮助。虽然PCR本身就是一种强大的独立技术，但它也已被纳入更广泛的技术中，例如克隆和测序，作为这些工作流程中一个小而重要的部分。基因转录-PCR可以检查特定时间点细胞类型、组织和生物体之间的基因转录变化。在此过程中，从目标样品中分离RNA，并逆转录成cDNA。然后可以根据PCR中扩增的cDNA量来定量特定基因的原始RNA水平。基因分型-PCR可以检测特定细胞或生物体等位基因的序列变异。一个常见的例子是转基因生物的基因分型，例如敲除和敲入小鼠。在此应用中，引物设计用于扩增转基因部分（在转基因动物中）或突变（在突变动物中）。克隆和诱变-PCR克隆是一种广泛使用的技术，其中通过PCR扩增的双链DNA片段入载体（例如gDNA、cDNA、质粒DNA）中。例如，这能够产生从中删除或插入遗传物质的细菌菌株。定点诱变也可用于通过克隆引入点突变。这通常采用一种称为重组PCR的技术，其中重叠引物专门设计用于掺入碱基替换。该技术也可用于创建新的基因融合。测序-PCR可用于富集模板DNA以进行测序。推荐用于制备测序模板的PCR类型称为高保真 PCR，能够保持DNA序列的准确性。在Sanger测序中，PCR扩增的片段随后被纯化并在测序反应中进行。在下一代测序（NGS）中，PCR用于文库制备阶段，其中DNA样品通过PCR富集以增加起始量，并用测序接头标记以进行多重检测。桥式PCR也是第二代NGS测序过程的重要组成部分。PCR既是一种独立的技术，也是其他方法中的主力，它已经改变了一系列学科。这些包括：基因研究-全球大多数实验室都使用PCR。最常见的应用之一是基因转录分析，旨在评估特定基因转录本的存在或丰度。这是一种通过克隆操纵生物体（动物、植物和微生物）基因序列的强大技术。这使得基因或基因片段能够入、删除或突变，以设计遗传标记、改变表型、阐明基因功能并开发疫苗等等。在基因分型中，PCR可用于检测特定细胞或生物体中等位基因的序列变异。它的用途也不仅限于人类。农业中的植物基因分型有助于植物育种者选择、提炼和改良其种畜。如上所述，PCR也是富集测序样本的第一步。例如，人类基因组计划（HGP）中的大多数作图技术都依赖于PCR。医学和生物医学研究-PCR用于许多医学应用，从疾病相关基因突变的诊断检测到传染源的鉴定。PCR在医学领域使用的另一个很好的例子是产前基因检测。通过PCR进行的产前基因检测可以识别胎儿的染色体异常和基因突变，为准父母提供有关婴儿是否患有某些遗传疾病的重要信息。PCR还可用作植入前遗传学诊断工具，以筛选用于体外受精（IVF）程序的胚胎。法医学-我们独特的基因指纹意味着PCR可用于亲子鉴定和法医调查，以确定样本的来源。例如，从犯罪现场分离出的小DNA样本可以与DNA数据库或嫌疑人的DNA进行比较。这些程序确实改变了警方进行调查的方式。真实性测试还利用PCR遗传标记，例如，确定肉类来源的物种。分子考古学也利用PCR来扩增考古遗骸中的DNA。环境微生物学和食品安全-通过PCR检测病原体，不仅在患者样本中，而且在食物或水等基质中，对于诊断和预防传染病至关重要。PCR是检测从生物医学研究到法医学应用各个领域核酸的基准技术。Kary Mullis的想法写在路边的收据背面，结果证明是一个革命性的想法。
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