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质谱分析水杨酸(SA)中葡萄糖醛酸代谢产物定量方法开发的思考

2021-2-23 23:10| 编辑: 小桔灯网| 查看: 1695| 评论: 0|来源: 临床与分析的哪些事

摘要: 前言前几天和一位友人讨论他的毕业课题,其主要目的是定量分析其代谢物在尿液中的暴露量,其它的代谢物均完成了定量分析,但在葡萄糖醛酸代谢产物的定量上遇到了一些困难,现就对其方法开发中需要注意的问题跟大家分 ...

前言

前几天和一位友人讨论他的毕业课题,其主要目的是定量分析其代谢物在尿液中的暴露量,其它的代谢物均完成了定量分析,但在葡萄糖醛酸代谢产物的定量上遇到了一些困难,现就对其方法开发中需要注意的问题跟大家分享下:


药物的葡萄糖醛酸代谢产物有2SAAGSAG,为同分异构体。代谢途径与结构式如下:(药物不是水杨酸,SA只是其中的一个代谢产物)


葡萄糖醛酸代谢产物如何定量分析?

方法1:间接定量(酶解法),用葡萄糖醛酸酶水解后,对SA进行定量分析


酶解法成功的主要因素:

①酶的来源,不同来源具有不同的酶解活性和最近工作PH

②酶解的环境,不同PH环境中,酶的活性不一样

③酶解的时间,

④酶的浓度,酶加入量的多少,决定了酶解的完全程度


方法2:直接定量,分别直接对SAAG与SAG进行定量分析

需考虑的问题如下:

①能够分别买到SAAG与SAG的对照品,且对照品的纯度足够的高,不产生相互干扰

②SAAG与SAG因分子量一样,需要色谱分离


其它考虑点:

色谱分离

  • 因SAAG与SAG因分子量一样,需要色谱分离,才能定量分析。可能需要用到一根较长的柱子以及较缓的梯度,已达到较好的分离效果

  • 葡萄糖醛酸为II相代谢产物,一般二相代谢产物为极性分子,且常常是无活性的,因而可以较快由体内排泄。因此它logP值一般较低,在常规色谱柱上有可能不保留,需要使用亲水性色谱柱


尿液基质


  • 尿液中缺少蛋白质和脂类(血浆中含6%~8%的蛋白质),因此药物容易与采集容器非特异性结合。
  • 大体积样品需要更长的时间冻融,尿液样品的冻融可能引起细胞碎片及盐类的析出,导至样品异质化。
  • 放置过久细菌分解尿液成分可导至pH改变,或因尿中的碳酸氢盐分解产生的二氧化碳会自然扩散到空气中,使pH增高。

葡萄糖醛酸结合物的稳定性

  • 水解和酰基移换在·中性和碱性条件下更易发生。为了防止和减缓这个过程,生物样品(血液、血浆、样品提取物)通常应在低温下处理并保持在酸性条件。
  • 尿液具有轻微的酸性,使得其相对稳定;但是尿液的pH常变化,这可能与其所含药物和处理储存的条件相关。在样品的收集、储存和处理中,保持尿液的酸度是至关重要的条件。


葡萄糖醛酸结合物的源内裂解


如何控制或减少代谢产物的内源裂解:
  • 一般认为ESI应优先于大气压化学电离(APCI),以减少内源CID或化合物的热分解

  • ESI源的锥孔电压参数与源温度对源内裂解起主要作用

  • 不同的加和离子,+NH4,以及负离子模式(-H),优于正离子模式(+H


可看这篇文章进行详细了解→液质分析方法—如何减少质谱分析中 II相代谢产物 源内裂解

内源性化合物的分析

生活中无处不在的水杨酸,因此可以预见体内也含有其代谢产物SAAG与SAG


内源性化合物是指体内产生或饮食中含有的化合物。若内源性化合物来源于食物:建议试验前及试验过程中严格控制该化合物自饮食摄入,统一标准化饮食。

  • 真实基质和真实分析物
在等分的生物基质中加入已知的不同浓度的待测物,以加入待测物浓度和测得的响应值做标准曲线,生物基质中内源性物质的浓度可以由标准曲线的截距计算而得。方法原理简单,有时可以排除基质效应的干扰;准确度会受到加入浓度的影响,本底浓度高、增量浓度相对较低时误差较大。这种方法适用于定量下限高于5倍本底响应的分析方法建立,现较少使用。

  • 替代基质和真实分析物

待测物的空白基质很难获取或空白基质中本底确实很高,很多研究人员选用替代基质用于分析方法的建立和验证。替代基质有很多种,最简单的是水或缓冲液,如磷酸盐缓冲液(PBS) ,也常在PBS中加入牛血清蛋白(BSA)或人血清蛋白(HSA),使其与生物基质更相似。

  • 替代基质和真实分析物

选择真实基质中不存在的替代分析物配制标准曲线,当使用质谱检测器时,稳定同位素标记物通常为最佳选择。此时替代分析物和真实分析物之间仅存在相对分子质量的差异,其他行为可视为一致。采用此法必须证明替代分析物与分析物在理化性质、提取回收率、色谱保留和仪器响应等性质完全一致。在方法建立时要使用同浓度的2种分析物纯溶液,考察两者响应关系。响应因子为两者的峰面积之比。许多因素如同位素标记不完全、纯度不准确、气相同位素交换、洗脱时间漂移等都会影响两者间的响应关系。因而建议在每个分析批前后考察两者的响应关系,调节碰撞能量使响应因子维持在一个恒定值(±5% )

写完之后感觉这位友人毕业课题中的这一小部分内容需考虑的问题还是蛮多的,希望他的实验能如期做完,顺利毕业。

以上内容纯属个人观点,有考虑不全或说错的地方,欢迎大家一起讨论交流。

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