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围观丨哪些生物技术在新冠病毒诊断/检测中应用?

2020-6-29| 编辑: 小桔灯网| 查看: 652| 评论: 0|来源: 嘉乐资本丨作者:李紫薇

摘要: 前言2019年12月底,在中国湖北省武汉市当地的一个海鲜和野生动物交易市场:武汉华南海鲜市场,一种可导至不明原因肺炎的病毒爆发了。在2020年1月7日,中国疾控中心CCDC确证了这是一种新型冠状病毒。2020年2月11日, ...





前言


201912月底,在中国湖北省武汉市当地的一个海鲜和野生动物交易市场:武汉华南海鲜市场,一种可导至不明原因肺炎的病毒爆发了。在20201月7日,中国疾控中心CCDC确证了这是一种新型冠状病毒。20202月11日,世界卫生组织将这次大规模流行疾病命名为2019-nCoV(2019-novel coronavirus disease),也称为COVID-19. 此外,国际病毒分类委员会将2019-nCoV命名为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)。20203月,COVID-19在全球爆发。新型冠状病毒从属于Coronaviridae Nidovirales 中的beta型(betaCoV),是一类衣壳包裹的单链RNA病毒。通常BetaCoV以啮齿类动物作为宿主,在无中间宿主的情况下很少感染到人类。然而分别在2003年爆发的SARS,和在2016年爆发的MERS同样从属于BetaCoV,并对人类的公共卫生安全造成了巨大的伤害。研究表明,新冠病毒与蝙蝠冠状病毒RaTG13具有98%的相似度,与蝙蝠类SARS病毒CoVZXC21具有89%的核苷酸序列相似性,与人类SARS病毒有79%的同源性。截止到目前,尚未出现对于新冠病毒有效的治疗手段和药物。


本次新冠病毒的爆发给我们带来了前所未有的危机,对人类健康和生命造成巨大的威胁,给全球经济带来了灾难性的损失。值得庆幸的是,21世纪以来生物科学的快速发展极大的提高了全球针对重大传染性疾病的应对能力。在本次疫情爆发的几天内,新冠病毒的完整基因组数据即被公开,一个月内,针对新冠病毒的核酸检测试剂盒即开发完毕、投入使用。目前,全世界的科学家、医务工作者、生物医药企业等已经团结起来,对该疾病进行更加深入的了解,为遏制新冠病毒的转播及开发有效的治疗、预防手段贡献力量。


本文将从COVID-19致病机理、检测/诊断技术两个方面,浅述生物技术在新冠病毒诊疗中的应用。




COVID-19致病机理


与其他的感染呼吸道的冠状病毒类似,SARS-CoV-2主要是通过空气传播:病毒通过空气中的小液滴或气溶胶被吸入肺部,从而感染患者。另外,SARS-CoV-2还存在尚未被确证的粪-口传match播途径。新冠病毒的平均潜伏期中位数约在4~5天,之后97.5%的感染者在11.5天内出现感染症状。其典型的早期感染症状与SARS十分类似,包括发热、干咳,一些病人出现呼吸困难、肌肉/关节疼痛、头晕/头痛、腹泻、呕吐及咳血等症状。症状出现5~6天后,病毒载量达到高峰,随着病毒对下呼吸道的感染升级,气道的炎症反应加剧,导至肺部组织破坏,一些严重的患者在症状出现89天左右出现急性呼吸窘迫症ARDS(表现为呼吸困难和血氧浓度降低)、细菌和真菌的继发性感染、免疫系统大量分泌抗炎细胞因子形成细胞因子风暴(CRS),以及多脏器衰竭等。最终,一些患者由于血氧过低、脏器衰竭等走向死亡(男性死亡率2.8%,女性死亡率1.7%)。


SARS-CoV-2通过其病毒衣壳上的刺突蛋白S中的RBD(receptor-binding domain)靶向呼吸道中的上皮细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞表面表达的ACE2angiotensin-converting enzyme 2)。如图所示,在感染过程中,SARS-CoV-2RBD与细胞表面的ACE2结合,诱导细胞的内吞作用。在该作用中细胞丝氨酸蛋白酶TMPRSS2也起到了一定的辅助。通过内吞,病毒的RNA顺利进入细胞质并进行迅速的翻译、表达、复制,造成细胞的裂解以及ATP、核苷酸等大量释放。这些细胞损伤信号被周围的上皮细胞、内皮细胞、肺泡巨噬细胞等接收,并诱导它们释放出IL-6IP-10,MIP1alpha,MIP1beta,以及MCP1等炎性因子。这些炎性因子吸引单核细胞、巨噬细胞和T细胞至感染处,进一步促进炎症反应,形成正向反馈机制。


在免疫应答不健全的情况下(图左),可造成更多的免疫细胞在肺部聚集,炎症反应加剧,最终导至肺部组织的破坏。而高浓度的炎症因子会随血液全身循环至多处脏器,造成多脏器损伤。此外B细胞分泌的非中和抗体(通过ADE. antibody-dependent enhancement),进一步加剧了器官损伤,最终导至器官衰竭。然而在正常的免疫应答中(图右),T细胞可在病毒扩散之前清除感染的细胞。患者体内产生的中和抗体可遏制病毒进一步感染、扩散,肺泡中的巨噬细胞可通过吞噬作用清除被中和的病毒颗粒和凋亡的细胞。快速的病毒清除可避免不必要的炎症反应,从而将肺部损伤降到最低,促进肺组织的痊愈。



1.新冠病毒感染细胞过程(图源:Nature Review Immunology  

 



COVID-19体外检测技术

 

 对于新型冠状病毒的检测对于预防、防治疾病扩散和进展具有举足轻重的作用。在疫情爆发的早期,由于人们对于疾病的认知不足,很容易从一些共有的临床表现上,把新冠和其他的肺炎、流感、普通感冒发烧混淆在一起。再加上新冠病毒的传播能力强、速度快、致死率高,如何有效、快速、准确的诊断出新冠感染患者,及时施以隔离、干预和入院治疗等手段,最大程度的切断感染源,挽救更多患者的生命成为此次疫情防治中的重中之重。


 病毒检测一般分为直接法和间接法。直接法包括病毒特异性抗原检测和病毒核酸检测(DNA或RNA);间接法即血清IgM和IgG抗体检测。在不同的病毒感染周期内,病毒的滴度在体内的分布发生变化,例如,在新冠感染的初期,病毒在下呼吸道大量繁殖,因而痰液、肺泡灌洗液浓度最高,随后病毒获得较强传播能力,因而在上呼吸道中鼻咽拭子样本中浓度更高,在患者逐渐康复过程中,其肛拭子的含量可能高于鼻咽拭子。此外,新冠病毒所检测的各种指标,包括抗原、核酸、抗体等出现和峰值分布的时间也并不一致。比如,核酸检测在病毒感染初期灵敏度较高;IgM抗体在感染早中期开始出现,滞后于核酸检测灵敏度窗口期;IgG抗体在感染中后期才出现,检测灵敏度高,但特异性较核酸、IgM检测较低,一般用于出院的辅助判断。目前,不管是中国新冠诊疗指南、美国FDA,还是WHO发布的文件,仍然将核酸检测作为新冠病毒确诊的金标准,而抗体检测可以作为核酸检测的重要补充。接下来,我们将对本次疫情中的一些主要体外检测技术进行介绍。

                                   

1. 核酸检测方法学

               

1

荧光定量RT-PCR

核酸检测具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点,是确诊新冠肺炎的“金标准”。首先需要对含有病毒的样本进行灭活提取RNA,通过逆转录的方式获得病毒的cDNA,然后通过一对和病毒基因组特定片段互补的引物进行PCR扩增,一般检测位于病毒ORF1ab和N基因上的两个靶标,同一份标本需要满足双靶标阳性或重复检测为单靶标阳性或两种标本同时满足单靶标才能确认SARS-CoV-2病毒核酸阳性。核酸检测样本类型一般为鼻咽拭子、痰液、支气管灌洗液和肺泡灌洗液。检测程序经过取样、留样、保存、核酸提取、上级检测等一系列步骤。


此处的“荧光”表示在PCR反应过程中引入荧光示踪物1.加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料(SYBR Green等)或2.荧光标记的特异性探针(Taqman等),其荧光信号的积累与PCR产物的浓度有一定的换算关系。在PCR过程中,仪器不断记录荧光信号,通过标准曲线法对未知模板进行定量分析。


图2.SYBR GREEN和TAQMAN探针QPCR原理(图源:WILEY ONLINE LIBRARY)


优点:荧光定量PCR技术引入国内已久,技术普及程度较高,各级医院大多都具备成熟的PCR人员。在应对疫情时,有足够的场地、设备、人员进行检测;对于复工、复学筛查,大量的第三方医学检验中心也具备承接大量检测服务委托的能力。从操作层面上来讲,荧光定量PCR上机后2小时即可拿到结果,灵敏度、特异度、准确度较高,有利于实现本次疫情中尽早诊断、尽早隔离、尽早干预的防疫方案。另一方面,国内在分子诊断领域已有诸多发展较为成熟的试剂厂家,具有成熟的研发、生产、质控、服务等经验,可快速在短时间内研发并保证大量试剂、服务的供应。

缺点:荧光定量PCR检测全过程步骤较多,操作时间较长,对于场地、人员有较高的要求。由于采样不当(采样位置,旋转拭子,擦拭次数)、标本保存不当(2-8摄氏度保存)容易造成“假阴性”而漏诊。另外,由于操作不规范,也可能引起样本污染导至的“假阳性”。



2

数字PCR(ddPCR)

数字PCR可以做到对目标核酸序列的定量和定性检测,将具有荧光定量PCR的反应物(Taqman探针或SYBR Green引物)加载到液滴式微流控芯片上,然后用ddPCR扩增仪进行扩增。在反应完成后可通过成像分析,输出原始数据,并经由软件分析得到最终结果。ddPCR以qPCR为基础,但可以做到绝对定量。即,将一个标准的qPCR反应分配到大量微小的反应器中(反应单元),每个反应器中包含1个或多个拷贝的目标分子(DNA模版),实现“单分子模版PCR扩增”反应。在反应结束后,通过判别“阳性”和“阴性”反应器结果,利用泊松分布原理进行统计分析,通过读取阳性反应单元的个数及比例从而得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

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