宫颈癌位列女性恶性肿瘤发病率的第2位。据世界卫生组织（WHO）报道，每年约有新增病例53万，其中发展中国家占80％。目前，宫颈癌和癌前病变的最佳检测方法是组织活检，但这种检测不仅昂贵而且是侵入性的。虽然科学家也开发了一些侵入性小的诊断方法，但往往不够准确或无法预测癌前病变。
截止到目前，有16种高风险HPV被认为可导至超过99％的宫颈癌，但仅检测到一种高危HPV并不意味着有癌症风险。为准确检测宫颈癌和癌前病变，来自法国的研究团队开发了一种名为“HPV RNA-Seq”的检测方法，该方法可以检测高风险人乳头瘤病毒（HPV）多个亚型的基因转录组，也能进行癌前病变的分子标志物检测。初步研究结果表明，该方法的检测性能与病理检测具有可比性，并可减少不必要的侵入性检测。近日，该研究成果在The Journal of Molecular Diagnostics发表。据悉，HPV RNA-Seq方法结合了多重RT-PCR和NGS测序技术，使用了定制的AmpliSeq panel，可在Thermo Fisher Scientific的Ion Torrent平台或Illumina系统上运行。根据JMD的研究报道，该panel共包括750个靶序列，需使用525个独特引物进行扩增。目前，病毒RNA被认为是检测宫颈癌的良好分子标志物。例如靶向E6 / E7 mRNA的HPV检测是基于HPV E6和E7基因的致癌特性。但E6和E7基因在短暂的HPV感染过程中也会表达，因此，很难确定癌前病变、癌症发展演变相关的基因表达阈值。另一方面，宫颈癌发展过程与HPV感染从急性感染转向持续的、转化性感染相关，其特征是高水平的E6和E7 mRNA，以及E2和L1基因的低表达。为避免这一问题，HPV RNA-Seq检测的是HPV转录组的整体状况，而不是仅关注E6 / E7的mRNA。文章通讯作者、巴斯德研究所研究员Marc Eliot表示：“该研究的原创性在于对整个HPV转录组进行了扩增和测序，而目前的分子检测只检测一两个基因或转录组。”虽然基于病毒DNA的HPV分子检测非常敏感，但在癌症或癌前病变的诊断中阳性预测值（PPV）比较低。因此，临床检查中必须使用辅助诊断方法，例如巴氏细胞学检查、镜检、组织学检查等。然而在多数情况下，这些侵入性检查可能被证明是不必要的。为验证HPV RNA-Seq的PPV，研究人员利用100余例宫颈癌、癌前病变患者样本和体外培养的宫颈癌细胞进行了概念验证评估。结果显示，HPV RNA-Seq鉴定癌前病变的PPV约为82％，敏感性为97.3%，NPV阴性预测值为93.8%。相比之下，其他针对HPV的DNA或RNA检测的PPV从未超过50％（在接受镜检的女性人群中）。
HPV RNA-Seq和HPV DNA鉴定的HPV基因型数量比较。 研究团队还利用新方法进行了HPV检测和分型，包括HPV 16、18、31、33等。同时还对检测到的所有HPV类型进行了癌前生物标志物的评估，这样对于感染多个HPV菌株的患者，就可以单独描述每种HPV基因型对宫颈癌病变的影响。研究发现，HPV特定的早期和晚期转录组reads也可作为癌前病理检测的生物标志物。
此外，研究人员将HPV RNA-Seq 与病理检测方法和分子检测进行了比较。其中分子检测是一种基于DNA芯片检测和病毒E1基因片段鉴定的CE标记试剂盒，可对18种高危型和6种低危险型HPV进行定性检测和基因分型。该试剂盒是实验室常用的HPV检测试剂盒。结果显示，HPV RNA-Seq的检测性能与常用诊断试剂盒性能相当，与病理检测也具有可比性。L1基因是HPV分型的重要基因，但在持续感染和癌前病变过程中，一旦整合到人类基因组中，该基因就有可能脱落。因此，目前的几种HPV DNA检测都是检测高危型HPV的L1基因，且使用同一种PCR引物。而HPV RNA-Seq检测HPV的所有转录组，即使 L1基因脱落，其他HPV转录信息也能被检测到。研究人员通过类似的病毒转录组信息训练并构建了回归模型。在回归模型的帮助下，研究团队发现HPV的转录组生物学特征与宫颈癌的演变有关，有助于预测宫颈病变。检测到HPV病毒并不意味着存在癌变风险，数月甚至数年的持续HPV感染是可能导至宫颈癌变的一个主要风险因素。Eliot表示：“HPV RNA-Seq是第一个结合HPV基因分型的检测方法，在癌前病变检测中具有较好的阳性预测值，并与病理检测具有可比性。”目前，研究团队计划将该方法进行商业化。但在最终实现商业化之前，该检测方法还需要在更大的队列中进行进一步的临床验证。RNA-Seq有助于观察替代基因剪接转录本、转录后修饰、基因融合、突变/SNP，以及随着时间的推移基因表达变化。研究人员表示，未来，HPV RNA-Seq将有可能成为宫颈癌筛查的二线检测手段，以减少HPV DNA检测阳性女性进行不必要的镜检。一旦在大型队列中评估了性能和医疗效益，广泛的HPV转录组检测或有可能替代临床一线的细胞学检查和DNA分子检测，并可同时进行HPV基因分型和癌前病变的分子标志物检测。1.Broad-Range Papillomavirus Transcriptome as a Biomarker of Papillomavirus-Associated Cervical High-Grade Cytology2.Transcriptome-Based HPV Assay Shows Correlation With High-Grade Cytology
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