免疫组化结果分析

HaHa

结果分析主要有两种方法：阳性着色细胞计数法和评分法。
阳性着色细胞计数法：是在40*光镜下，随机10个视野下计数阳性着色细胞；
评分法：在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色）和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。
1.对照染色
没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照一般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身对照。一般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照就足够了。

2.定位
抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。

3.肉眼定量
因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化的半定量一般就分为三级：弱（+），中（++），强（+++）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）=3。至少随机观察5-10个视野。然后根据（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3计算出数值；总数值<1.0者为（+），1.0-1.5者为(++), >1.5者为(+++)。

图像分析软件
如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析软件，图像分析软件类型很多。Image J为例，一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了其界面非常简洁，如下图所示：





现在，根据一个实例来看看如何用Image J来进行图像分析。如下图所示，我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。那么，如何用Image J来计数细胞的个数呢？





首先，要把彩色的图像转换成黑白图像。
步骤如下：Image→Type→16-bit。转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。
步骤如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖动鼠标，直到所有的细胞被标示出来。





有时候2个细胞靠得比较紧密，会被计数为1个细胞。这个时候可以采用Image J的水洗功能。

步骤如下：Image→Binary→Watershed。如下图的蓝色箭头所示，这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地被计数成2个细胞。





然后，就可以正式开始分析了。
步骤如下：Analyze→Analyze Particles。在得出最后的结果之前，还有一些选项需要选择。
如果想要计数全部的细胞，那么Size项里面选择“0-infinity”。Circularity的默认值为“0.00-1.00”。一般就取默认值。





最后的结果如下图所示。软件自动测量了每个细胞的大小。这里因为是二维图像，所以就是每个细胞的面积。然后计数了一共有72个细胞，总面积为21286.00，平均大小为295.64。





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