【protocol分享】了解流式细胞术

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流式细胞术 Flow Cytometry; FCM
流式细胞术是对悬液中单细胞或生物粒子进行定量分析和分选的技术，具有速度快、精度高、准确性好的优点，广泛应用于细胞计数、细胞分选、分子表型分析蛋白质工程等研究。


历史发展
第一种流式细胞仪公开：1953年，美国工程师Wallace H.Coulter在美国专利号2,656,508中公开了使用Coulter原理的第一种基于阻抗的流式细胞术装置。
流式分选仪发明：1965年，美国加州大学物理学家Mack J Fulwyler在《科学》杂志上发表了关于流式分选仪的文章。他是当今流式细胞仪的先行者，也是细胞分选仪的发明者。
第一台荧光流式细胞仪发明：1968年，德国明斯特大学的Wolfgang Göhde开发了第一种基于荧光的流式细胞仪（ICP 11），并在1968年12月18日申请专利。
改进型细胞分选器的发明：1972年，美国斯坦福大学Leonard A. Herzenberg研制出一个改进型的细胞分选器，能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱荧光信号。
首次发明了荧光激活细胞分选技术：1974年，美国Becton Dickinson公司首次发明了荧光激活细胞分选技术（FACS）。
流式细胞术名称的确定：1976年，在美国佛罗里达州彭萨科拉举行的第五届美国工程基金会自动细胞学会议上同意使用“流式细胞术”这个名称。
推出首款无标签高频阻抗流式细胞仪：2012年，瑞士Amphasys公司推出了基于微流控技术的首款无标签高频阻抗流式细胞仪。
基本原理


流式细胞仪主要由以下五个部分构成：①液体流动系统；②激光及光学系统；③光学系统；④信号处理与分析系统；⑤细胞分类筛选系统。
流式细胞术的基本原理是把待测样先制成单个细胞的悬浮液，然后用特异性荧光染料将此悬液进行染色，染色后的样品放入样品管，通过气体的压力使样品进入鞘液；鞘液与样品之间会形成一定压力，当这压力达到一定程度后，在鞘液的带动下，单细胞悬浮液样品会形成单细胞柱状经过激光聚焦区，样品柱与激光束垂直，由于样品经特异性染料处理，因此经激光激发下会产生特定波长的荧光。流式细胞仪中的光学系统收集到荧光信号后进行信号处理，再经过计算机系统对处理的信号进行存储、显示，然后通过统计分析从而获得所需要的检测结果。由于荧光标记所使用的单克隆抗体种类不同，可以通过定量检测出细胞上的不同抗原物质来区分细胞，也可以用来分析细胞成分。
技术路线


流式细胞术实验
细胞分离和纯化  细胞的制备  细胞分化  细胞毒性
细胞凋亡  细胞增殖  产前诊断
在完整脾脏的流式细胞测定中，我们用各种TLR配体刺激直接离体使用的脾细胞。刺激脾细胞总共4小时，然后染色细胞内细胞因子。然后我们通过流式细胞术检查细胞因子的产生。这使我们能够比较最小操作的原代巨噬细胞/单核细胞和常规树突细胞的反应。
一、材料试剂准备


PerCP / Cyanine5.5抗小鼠/人CD11b抗体

• BD Pharmingen™ PE-Cy™ 7 Hamster Anti-Mouse CD11c
  
• BD Pharmingen™ APC-Cy™ 7 Rat Anti-Mouse CD19
  
• APC抗小鼠CD3ε抗体
  
• FITC TNF α 单克隆抗体
  
• BD Pharmingen™ PE Rat Anti-Mouse IL-12 (p40/p70)
  
• BD Pharmingen™ Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32
  
• BD Pharmingen™ FITC Rat Anti-Mouse CD8a
  
• BD Pharmingen™ PE Rat Anti-Mouse CD8a
  
• PerCP / Cyanine5.5 抗小鼠CD4抗体
  
• PE / Cy7抗小鼠CD8a抗体
  
• BD Pharmingen™ APC Rat Anti-Mouse CD8a
  
• 脂质 IVa
  
• ODN1826 (Coley Pharmaceuticals)
  
• BD Cytofix/Cytoperm™ 固定和透化液
  
• BD Perm/Wash™ Perm/洗涤缓冲液
  
• 多聚甲醛
  
• RPMI 1640 Medium (with glutamax, HEPES, Phenol red) (Life Technologies, catalog number: 72400-120 )
  
• 胎牛血清
  
• Beta-ME (Sigma-Aldrich, catalog number: M-7522 )
  
• 氯化钠
  
• 氯化钾
  
• 磷酸氢二钾
  
• 磷酸氢二钠
  
• 氢氧化钠
  
• 十六烷基三甲基氯化铵
  
• 碳酸氢钠
  
• 10×PBS缓冲液
  
• 1x PBSA/azide (PBSA/az) (see Recipes)
  
• Brefeldin A (Sigma-Aldrich, catalog number: B6542 ) (see Recipes)
  
• 锥形离心管
  
• Corning® 瓶顶真空过滤器
  
• 细胞培养皿
  
• 96孔板 2.2mL
  
• 乙二胺四乙酸(EDTA)
  
• 盐酸
  
• 圆底连盖离心管
  
• 载玻片双头磨砂
  
• 1×PBS缓冲液
  
• VITLAB® Dr. Schilling 滴定管
  

二、所需仪器设备

• 离心机   2. 流式细胞仪
  

三、实验步骤
脾细胞分离


1.取出小鼠脾脏放入15ml离心管中（无液体），再将离心管放在冰中。
2.将5ml RBC裂解缓冲液加入15ml含脾脏的离心管中。
3.将RBC裂解缓冲液和脾脏倒入10 cm细胞培养皿中。
4.将脾脏置于载玻片双头磨砂（用RBC裂解缓冲液润湿）的粗糙侧面上，在载玻片双头磨砂中彻底粉碎脾脏，并在两个载玻片双头磨砂之间研磨，直至脾脏解离。
5.移取含有脾细胞的RBC裂解物于15ml 离心管中。
6.向离心管中加入10ml培养基，倒置2-3次。
7.在4℃下以1300rpm离心00:05:00。
8.弃去上清液，将沉淀重悬于3ml培养基中。
9.通过50ml离心管过滤70 μM过滤器
10.按1：100稀释细胞，然后计数。
11.在RPMI培养基中，将单细胞悬浮液稀释至1×107个细胞/ml（对于流动测定，不需要计数和计算细胞）。
12.将脾细胞置于冰上直至进入96孔板。
刺激脾细胞
1.准备一份含有布雷菲德菌素A的RPMI培养基，使之浓度达到10 μg/ml。
2.涡旋并旋转所有LPS储备液，然后每个超声处理00:10:00。超声处理后，再次涡旋并旋转。
3.使用含有布雷菲德菌素A的培养基将每种刺激物（EC LPS，PA，YP，脂质IVa）制备成其所需最终浓度的两倍（2x）。
4.将100μl的每种刺激物加入到96孔板 2.2mL的适当孔中，包括未刺激的孔作为对照。
5.将100μl脾细胞铺板到适当的孔中（平板另外一组脾细胞用作单一染色对照）。
6.然后在37℃孵育04:00:00。
免疫细胞化学（ICC）染色
1.04:00:00后，用20μl20 mM EDTA处理孔板。
2.混合并在37℃下孵育00:10:00。
3.孵育后再次混合，然后以1300rpm离心00:05:00。
4.吸出或轻弹介质。
5.用10μl稀释的FcBlock（在PBSA / az中1：100FcBloc）封闭至所有孔。
6.在冰上孵育00:15:00。
7.加入100μlPBSA/ az，然后以1300rpm离心00:05:00。
8.吸出或轻弹介质。
9.用10μl抗体混合物重悬/染色：CD11b PerCP-Cy5.5、CD11c PE-Cy7、CD19 APC-Cy7和CD3 APC（PBSA/az中1：100Ab）至刺激的脾细胞样品。
10.向单一染色对照中加入100μlPBSA/az，然后加入1μl这些单一染色Ab：CD8 FITC、CD8 PE、CD4 PerCP-Cy5.5、CD8 PE-Cy7、CD19 APC-Cy7和CD8 APC。
11.在冰上避光（或用箔包裹）孵育00:20:00。
12.加入100μlPBSA/az，然后以1300rpm离心00:05:00。
13.吸出或轻弹介质。
14.用100μlBDcytofix / cytoperm溶液重悬于所有孔中。
15.在冰上避光孵育00:20:00。
16.向所有孔中加入100μl1xBD Perm洗液。
17.以1300rpm离心00:05:00，然后吸出或轻弹介质。
18.用200μl1xBD Perm洗液重新悬浮/洗涤一次，通过向上和向下移液几次到所有孔中。
19.以1300rpm离心00:05:00，然后吸出或轻弹介质。
20.用50μl抗体混合物重悬/染色：TNF FITC和IL-12 / IL-23p40 PE至刺激的脾细胞样品。
21.在冰上避光孵育00:30:00。
22.向所有孔中加入150μl1xBD Perm洗液，然后以1300rpm离心00:05:00。
23.吸出或轻弹介质。
24.用200μl1xBD Perm洗液重悬/洗涤一次，通过向上和向下移液几次到所有孔中。
25.以1300rpm离心00:05:00，然后吸出或轻弹介质。
26.重悬于终体积为200μl的1％多聚甲醛溶液（用1xPBS中稀释10％多聚甲醛）。
27.在4℃下避光保存（或用箔包裹），直到准备进行流式细胞仪检测- 在FACS之前立即将样品从96孔板转移到滴定管中。
使用流式细胞仪


1.在BD FACS Canto I软件上，选择设置“新实验”按钮。
2.选择FSC和SSC的面积、高度、宽度;选择日志和区域颜色作为“FITC”、“PE”、“PerCP/Cy5.5”、“PE/Cy7”、“APC/Cy7“和“APC“（在Inspector框下）。
3.创建补偿控制并调整未染色脾细胞的门控（根据需要调整FSC和SSC电压）。
4.调整电压面板中单个污渍的每种颜色，使正峰值达到104标记。
5.单一染色中，PerCP/Cy5.5使用抗CD4，APC/Cy7使用抗CD19，FITC、PE、PE/Cy7和APC使用抗CD8。
6.在对每个单个污渍进行任何调整并记录后记录所需的电压，然后计算补偿控制。
7.现在可以记录事件 - 设置为收集500000-1000000个事件。
以上资料来源【MedPeer】实验知识库


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