一文带你了解经典分子生物学实验：Southern杂交

生物科研实验室

一、实验原理

Southern杂交通过限制性酶切→电泳分离→毛细管转膜→探针杂交四步，特异性检测目标DNA序列。其原理是利用探针与酶切后DNA片段互补结合，经放射自显影或化学发光在膜上呈现条带，如同给DNA贴上“专属标签”。
二、试剂与设备 1.限制性内切酶：根据目标序列选择（如EcoRⅠ识别GAATTC），每μg DNA用10U酶，37℃消化过夜 2.电泳凝胶：0.8%琼脂糖凝胶（1g琼脂糖+100mL 1×TAE），溴化乙锭（EB）终浓度0.5μg/mL 3.转膜缓冲液： •碱性转膜（适用于尼龙膜）：0.4M NaOH •中性转膜（适用于硝酸纤维素膜）：20×SSC溶液（NaCl 87.65g + 柠檬酸钠44.1g + 1L水，pH 7.0） 4.探针标记： •同位素（³²P-dCTP）：用随机引物法标记，需防护设备 •地高辛（DIG）：安全高效，抗地高辛抗体-AP显色
三、操作流程 步骤1：DNA酶切与电泳 •取10μg基因组DNA + 5μL 10×缓冲液 + 3μL EcoRⅠ + 补水至50μL，37℃孵育16小时 •65℃灭活5分钟，取20μL上样于0.8%琼脂糖凝胶，5V/cm恒压电泳至溴酚蓝迁移4cm 步骤2：凝胶预处理 •凝胶浸入0.25M HCl中脱嘌呤15分钟→蒸馏水漂洗→转入变性液（0.5M NaOH/1.5M NaCl）30分钟→中和液（0.5M Tris-HCl pH7.4/1.5M NaCl）30分钟 步骤3：毛细管转膜（经典法）
1.托盘盛满20×SSC，搭滤纸桥浸湿 2.依次铺：凝胶→尼龙膜→3mm滤纸→5cm吸水纸→0.5kg重物 3.转膜16小时，中途换吸水纸防饱和
步骤4：紫外交联固定 •膜浸入6×SSC 5分钟，滤纸吸干 •UV交联仪1200J/cm²照射45秒（或80℃烘烤2小时）
步骤5：探针杂交与洗膜 •预杂交：膜浸入预杂交液（6×SSC, 5×Denhardt’s, 0.5% SDS, 100μg/mL鲑鱼精DNA），68℃震荡1小时 •杂交：加入煮沸变性的探针（10⁶ cpm/mL），68℃震荡过夜 •洗膜： •低严格度：2×SSC/0.1% SDS 室温5分钟×2次 •高严格度：0.1×SSC/0.1% SDS 68℃ 15分钟×2次（监控背景）
步骤6：信号检测 •同位素法：膜包保鲜膜，-80℃压X光片1-7天 •地高辛法：膜浸入抗DIG-AP抗体（1:5000），37℃ 30分钟→洗膜→NBT/BCIP避光显色20分钟