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奋斗的小鸟

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队长是我

​在产卵期间，成年太平洋鲑科鱼类（大麻哈鱼属等物种）会完成极具挑战性的溯河洄游，在此过程中，在个体心脏能力的限制下，能量和氧气的供应必须分配到诸如游动、成熟和产卵行为等活动中。为了加深我们对自由游动鱼类心脏功能的理解，研究人员在安大略省锡登纳姆河河口附近采集了洄游的成年奇努克鲑鱼（大麻哈鱼属的一种），并为它们植入了心率生物记录仪，该记录仪每 3 分钟记录一次心率，直到这些一生只繁殖一次的鱼在几天后于产卵地死亡。研究人员对心脏功能的基本方面进行了量化，包括静息心率、日常心率和最大心率，以及心率范围（最大心率减去静息心率）。研究人员使用广义最小二乘法回归来探究心率的预测因素，这些因素包括水温、流量、鱼的大小以及鱼的来源（野生还是人工孵化场养殖）。心率与水温呈正相关，这与每日和季节性的变化密切相符。野生鱼的静息心率比人工孵化场养殖的鱼要慢，这使得野生鱼的心率范围明显更高。我们的研究结果表明，野生鲑鱼在洄游期间的心脏能力可能比人工孵化场养殖的鱼更好，这可能有助于野生鱼洄游成功。


一、引言
太平洋鲑鱼物种（大麻哈鱼属等物种）进行着动物王国中一些最具挑战性的洄游，它们常常要溯河游动数百公里去繁殖。和大多数鱼类一样，鲑科鱼类进行身体活动（如游泳）的能力取决于它们产生能量的有氧代谢能力，而有氧代谢能力又取决于心血管系统为组织供应氧气和营养物质的能力。鱼类可以通过改变每搏输出量来调节心血管功能，但对于大多数鱼类来说，这主要是通过提高心率来实现的（心率）。在洄游期间，心血管功能对整个动物的表现至关重要，因为这些洄游运动通常是动物生命周期中最具挑战性的时期。对于一生只繁殖一次的鲑科鱼类物种来说尤其如此，它们在洄游后只有一次繁殖的机会，这通常需要长时间的有氧游泳以及反复的爆发式（无氧）游泳来穿越高流速的河段。事实上，有假设认为，太平洋鲑鱼在洄游期间心脏功能的衰竭是其产卵前死亡背后的生理机制。因此，深入了解洄游期间的心脏表现以及影响心脏生理学的因素，对于有效地保护和管理太平洋鲑鱼种群是十分必要的。

各种生物和非生物因素可能会影响鲑科鱼类在产卵洄游期间的心脏表现。温暖的水温对心血管系统维持组织氧气供应提出了更高的要求。在高温下，心脏可能没有足够的能力将必要的氧气输送到全身，这可能会导致洄游失败，甚至死亡。同样，已知鱼类的体型或性别等生物因素会影响代谢率。在理论上，对于具有封闭循环系统的动物来说，耗氧率和心率应该与体重普遍成比例，但实际情况往往并非如此。心血管比例关系的这一概念在鱼类中尚未得到彻底研究，尽管一项对奇努克鲑鱼的研究并未发现心率与体重成比例的证据。

个体的生活史，包括生长条件，会影响动物的表型，并且已被证明会改变心脏的形态和生理机能。这表明，在野生环境与人工孵化场环境中养殖的鱼（这是鲑科鱼类的常见做法），其心脏表现可能会有所不同。与野生鲑科鱼类相比，养殖的鲑科鱼类的心脏在方向、形状和排列方面常常表现出异常。据研究人员称，心脏异常的一个主要促成因素可能是早期生长阶段的加速生长速度 —— 这在人工孵化场中很常见，在那里鱼可能会被过度喂养，而且代谢消耗比在野外低。此外，早期生长阶段（直到幼鲑阶段）的生长速度与在人工孵化场养殖一年后出现的心脏异常（如心室变圆）有关。与养殖和人工孵化场养殖的鲑科鱼类相关的形态异常（即心室形状和排列）可能会导致心脏功能受损、游泳性能下降和死亡风险增加。确实，据观察，人工孵化场养殖的鲑科鱼类与野生鲑科鱼类相比，繁殖适应性更低，这表明早期的生长条件确实会对与适应性相关的特征产生长期影响。然而，关于生长条件的差异是否会对鲑科鱼类的心脏功能产生终身影响，我们知之甚少。有记录表明，人工孵化场的养殖环境在太平洋鲑科鱼类的表观遗传变异中占很大比例，而且可以想象，这些变化可能会导致终身的表型改变。

虽然关于鲑科鱼类心脏功能存在大量的信息，但我们所了解的大部分内容都来自在圈养环境中进行的实验，这些实验可能会简化自然环境中的条件。此外，之前对游泳期间心脏表现的评估中，大多数信息来自在实验室环境中进行的实验，在这些实验中，鱼被拴在记录设备上，在封闭空间（如游泳隧道）中游泳。然而，生物记录仪技术的最新发展提高了我们评估自由游动的鱼在其自然环境中的生理表现的能力。为了加深我们对自然环境中鱼类心脏功能的理解，研究人员从位于安大略省欧文桑德的锡登纳姆河采集了成年奇努克鲑鱼，并为它们植入了心率生物记录仪，在它们溯河洄游期间监测心率，直到鱼在产卵地死亡。研究人员对心脏功能的基本方面进行了量化，包括静息心率、日常心率和最大心率，以及心率范围（最大心率减去静息心率）。研究人员探究了各种生物和环境预测因素的影响，包括鱼的来源（野生还是人工孵化场养殖）、水温、鱼的体型以及流量。研究人员预测，野生鱼的心脏表现会比人工孵化场养殖的鱼更好（即心率更低且心率范围更大），水温与流量都与心率呈正相关，而且体型更大的鱼心率会更低。这项研究的结果将拓展我们对自然环境中野生鱼类心脏生理学的认识。


二、方法
01. 实验动物和研究地点
来自五大湖流域的奇努克鲑鱼，其生活史与它们原生范围（即太平洋）中的溯河性奇努克鲑鱼相似，但它们洄游进入的是一个大型淡水湖（休伦湖），而不是洄游到海洋环境。值得注意的是，奇努克鲑鱼在安大略省锡登纳姆河的溯河洄游相对较短（不到 7 公里），远不如在其他流域（如哥伦比亚河、弗雷泽河或育空河）中完成的洄游那么长或具有挑战性，在那些流域，它们可能要溯河洄游 1000 多公里才能到达出生地产卵地。安大略省欧文桑德的锡登纳姆河已经形成了一个野生种群，但由当地的运动员协会完成的人工孵化场补充养殖对其起到了支持作用 。亲鱼于 9 月和 10 月在欧文桑德的米尔大坝鱼道（图 1）采集，幼鱼在韦弗溪的一个孵化场养殖，韦弗溪是一条支流，位于锡登纳姆河河口上游约 3 公里处。水从韦弗溪引到孵化场，鱼通过定时喂食系统进行喂食。0 龄奇努克鲑鱼每年春天被放流回河中（在 中讨论过），在休伦湖摄食 2 至 4 年后作为成年鲑鱼返回产卵 。这些鱼在其生命周期中，在返回出生溪流之前，很可能在整个湖中广泛游动 。




图1. 研究地点，位于安大略省的锡登纳姆河。奇努克鲑鱼（大麻哈鱼属的一种）从休伦湖的乔治亚湾向南洄游到锡登纳姆河。鲑鱼在位于河口上游 2 公里处的米尔大坝被标记。图中显示了植入心率记录仪和无线电遥测发射器的人工孵化场来源（红色符号）和野生来源（蓝色符号）的奇努克鲑鱼的最终位置。

2019 年 10 月 8 日至 11 日，在安大略省锡登纳姆河河口上游约 2 公里处的米尔大坝采集了 20 条雄性奇努克鲑鱼（图 1）。鱼是用抄网从米尔大坝鱼道出口处的收集篮中，或从一条临时注水以方便捕鱼的侧渠中捕获的。捕获后，根据脂鳍的有无来确定每条鱼的来源（野生还是人工孵化场养殖）。产卵地点分布在大坝上游英格利斯瀑布（一个无法通过的瀑布）下方约 5 公里长的河段中。由产卵地组成的这段河流通常相当浅，鱼可能必须进行爆发式游泳才能穿越高流速的区域。一个水文测量站（加拿大环境部）在英格利斯瀑布上游每隔 5 分钟记录一次流量。




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02.手术程序
将一条鱼从其采集地点转移到一个手术槽中，并使用一副输出电流为 10 毫安的电鱼操作手套使其失去活动能力。与化学镇静剂相比，已知电鱼操作手套能让失去活动能力的鱼迅速恢复生理和行为状态 。在整个手术过程中，河水不断地泵送到鱼的鳃上。沿着鱼腹部中线，在胸带后方约 3 厘米处做一个大约 5 厘米的切口。将一个心率记录仪（DST milli HRT（13×39.5 毫米，11.8 克），冰岛的 Star-Oddi 公司生产）在背腹方向上放置在心包膜旁边，并使用 2-0 单丝缝合线（PDS II 聚二氧六环酮缝合线）直接固定在体壁上。心率记录仪通过一段大约 8 厘米长的单丝线连接到一个无线电遥测发射器（I80（27×10 毫米，4.2 克））上。将无线电标签放置在记录仪后方的体腔内，以减少对心率记录仪的电干扰可能性。为了便于植入，将无线电遥测发射器的天线盘绕并固定在发射器周围，并尽量减少天线对内部组织的刺激。根据安大略省奇努克鲑鱼的体长 - 体重关系，心率记录仪和无线电发射器的总标签负担（16 克）约为鱼体重的 0.3% 。一项评估 0.7% 标签负担（15.1 克）和体腔内手术对成年大西洋鲑（Salmo salar）影响的研究发现，与未标记的对照组相比，在不同游泳速度下，其耐力或血液生理学方面没有差异，这表明我们的标签负担对我们的研究动物是合适的。使用三针单间断缝合线（PDS II 聚二氧六环酮缝合线）缝合切口，并在背鳍后面系上一个面条状标签以便进行视觉识别。完成这些程序后，鱼立即被放流到大坝上游。在对下一条鱼重复使用之前，手术设备浸泡在聚维酮碘（碘伏）中进行消毒。鱼类的捕获和手术是按照卡尔顿大学制定的加拿大动物护理委员会指南（动物使用协议编号 103 128）进行的。


03.数据收集、处理和计算
心率记录仪按照制造商对鱼类研究的建议，被编程为以 125 赫兹的频率、4.8 秒的测量周期，每 3 分钟记录一次温度和心率。每 9 分钟测量一次原始心电图（ECG）波形，以验证计算出的心率测量值的质量。无线电遥测发射器被编程为每 2.6 秒发射一个 10 毫秒的脉冲。使用一个无线电遥测接收器（SRX800）和一个三齿八木天线进行主动跟踪，以便从被标记的鱼身上回收记录仪。在最后一条鱼被标记后的第 4 天、第 9 天和第 15 天，通过步行对整个产卵地进行了主动无线电跟踪调查。使用零点跟踪（即连续降低增益）来定位鱼，这使得能够在 2 平方米的范围内识别标签。在大多数情况下，标签是在岸边或尸体外的浅水中找到的，附近有被捕食和 / 或食腐的迹象（如粪便、鱼鳞、椎骨）。心率数据最初在数据记录软件 Mercury（冰岛的 Star-Oddi 公司生产）中进行处理，通过确定平均 R-R 间隔，即心电图中两个连续 R 波之间的时间（反映心室去极化）。在 Pattern Finder（冰岛的 Star-Oddi 公司生产）软件中对一部分测量值（每个记录仪大约 50 个）的心电图进行人工检查，以验证心率计算结果。基于此验证，只保留质量指数为 0 的心率数据（软件指定的质量测量值，范围为 0-3），并删除所有其他观测值（按照 ）。对于一个记录仪，质量指数为 1 的数据被保留，因为它与经过验证的心电图数据高度一致。对所有有相应心电图的测量值进行人工计算，以取代质量指数为 1 或 2 的测量值。一小部分心电图（不到 1%）没有可识别的 R 波，无法进行人工计算。在量化每条鱼的心率参数时，去除最初 7.5 小时的测量值，以考虑与捕获和手术程序相关的心率升高（类似于洄游鲑科鱼类在 中的恢复时间）。一旦心率在最初的峰值后趋于平稳，并恢复到或低于日常心率，就认为鱼已经从手术中恢复。在死亡前的几个小时（每条鱼 1-13 小时）内，当心率迅速下降时的所有心率测量值也从静息 / 日常心率的计算中去除，而是用于对死亡前心电图的单独分析，包括量化 R 波振幅（即典型心电图中最大的向上偏转）和心律失常的存在（电子补充材料，图 S4）。R 波振幅测量为测量期间 R 波峰值与平均基线之间的差值（以毫伏为单位）（取该测量期间的中值）。心律失常被确定为具有不规则心跳和 / 或缺失 QRS 复合波（即心电图上对应于心室去极化的三个图形偏转）的测量序列。寿命（天数）取为从标记到鱼死亡前最后一个有效心率观测值之间的经过时间。洄游距离计算为米尔大坝与产卵地产尸体或标签回收位置之间沿河流的距离。沿河流的距离使用 R 语言中的 riverdist 包计算。静息心率计算为洄游过程中心率值最低的 10% 的平均值，日常心率取所有心率的平均值，而最大心率取心率值最高的 10%（这可能低估了最大心率，但我们没有圈养鱼，所以无法通过运动迫使鱼达到峰值心率 ）。心率范围反映了个体鱼的最大心率和静息心率之间的差异。


04.统计分析
使用单独的单因素方差分析（ANOVA）检验，评估野生鱼和人工孵化场养殖的鱼在水温、全系统流量（5 分钟分辨率）、寿命（天数）、洄游距离（公里）和叉长（毫米）方面的差异。使用线性回归模型评估叉长和洄游距离之间的关系。使用单独的单因素方差分析评估人工孵化场养殖的鲑鱼和野生鲑鱼在静息心率、最大心率和心率范围方面的差异。使用线性回归对静息心率和心率范围之间的关系进行建模。使用 R 语言中 nlme 包的‘gls’函数，通过广义最小二乘法回归对洄游过程中心率的预测因素进行建模 。该模型包括来源、水温、流量和叉长作为预测因素。使用相关结构‘corAR1’指定个体的嵌套效应和时间自相关（time|ID） ，以考虑从每个个体获得的重复（时间相关）测量值。对残差图的目视检查没有发现与模型假设的显著偏差 。没有尝试对初始候选模型进行简化。当 p≤0.05 时，认为具有统计学显著性。所有分析的数据和代码作为电子补充材料提供。


三、结果
01. 概述
对 20 条雄性鲑鱼完成了手术，从标记到放流的整个过程持续了 10.7（8.5–16.7）分钟。在标记后的几个小时内，心率恢复到了日常水平（4.4（1.75–6.4）小时；电子补充材料，图 S1）。大多数鱼（n = 18）完成了它们向上游 2 公里到产卵地的洄游，并且从其中 12 条鱼身上回收了标签，包括 7 条野生来源的鱼和 5 条人工孵化场来源的鱼。在洄游过程中的环境条件，包括水温（10.5（7.5–14.1）°C）和流量（0.7（0.6–1.3）立方米每秒），在野生鱼和人工孵化场养殖的鱼之间没有显著差异（即来源方面，见表 1）。同样，没有生物因素，包括叉长（691（578–774）毫米）、标记后的寿命（7.4（4.9–11.3）天）或洄游距离（3339（2024–4141）米），在不同来源的鱼之间有显著差异（所有 p > 0.05；见表 1）。与较小的鱼相比，较大的鱼向上游洄游到产卵地点的距离显著更远（R² = 0.47，T11 = 3.0；p = 0.01）。心率往往在死亡前的几个小时内下降（电子补充材料，图 S3）。尽管没有完成对照研究来评估其影响，但在测量期间，无线电发射器似乎并没有显著影响心率记录仪的记录轨迹。




表1. 野生组和人工孵化场组（即来源）的水温、流量（计算为研究期间的平均值）、寿命、叉长和洄游距离。数值以组内平均值表示，括号内为最小值和最大值，此外还有通过单因素方差分析模型得出的 t 值和 p 值。


02. 心率和心率范围的预测因素
在洄游的奇努克鲑鱼中，心率在每分钟 13 次（接近死亡时）到 91 次之间变化（图 2 和电子补充材料，图 S2），平均日常心率为 56.9 ± 6.1 次每分钟。鲑鱼的平均静息心率为 43.5 ± 7.6 次每分钟，平均最大心率为 71.0 ± 5.4 次每分钟，从而得出平均心率范围为 27.5 ± 6.9 次每分钟。虽然野生鲑鱼的静息心率往往低于人工孵化场养殖的鲑鱼（分别为 40.5 ± 8.0 次每分钟和 47.7 ± 5.0 次每分钟，t 值 = -1.77，p = 0.11），但最大心率相似（分别为 71.5 ± 5.6 次每分钟和 70.3 ± 5.7 次每分钟），这意味着野生鲑鱼的心率范围显著高于人工孵化场养殖的鱼（分别为 31.0 ± 6.8 次每分钟和 22.6 ± 3.4 次每分钟；t 值 = 2.51，p = 0.03；图 3）。此外，在奇努克鲑鱼中，心率范围与静息心率呈负相关（t 值 = -3.28，p < 0.01）。




图2. 安大略省锡登纳姆河的人工孵化场（n = 5）和野生（n = 7）奇努克鲑鱼（大麻哈鱼属的一种）在产卵洄游期间心率响应的昼夜周期。数据按白天（黄色）和夜间（白色）呈现，尽管在任何给定时间，个体鲑鱼可能分布在河流的不同位置。为人工孵化场养殖的鱼和野生鱼都拟合了一个广义相加模型平滑曲线。




图3. 该图展示了（a）静息心率（p = 0.09），（b）最大心率（p = 0.75）和（c）心率范围（p = 0.03），数据来自安大略省锡登纳姆河的人工孵化场（n = 5）和野生（n = 7）奇努克鲑鱼（大麻哈鱼属的一种）在产卵洄游期间。数据以平均值 ± 标准差呈现。

广义最小二乘法回归表明，在洄游过程中，野生鱼的心率与人工孵化场养殖的鱼的心率有显著差异（表 2 和图 2）。对小提琴图的目视检查表明，与人工孵化场养殖的鱼相比，野生鱼的心率往往更低且变化更大（分别为 55.6 ± 6.9 次每分钟和 58.7 ± 4.9 次每分钟；图 4）。水温对心率有显著的正向影响（R² = 0.16；图 5），随着水温从 14.1°C 降至 7.5°C，在洄游过程中导致了与温度相关的心率昼夜和季节性模式（表 2 和图 2）。流量对心率有显著影响，但与心率的关系在个体鱼之间并不一致（即有些鱼的关系为正，而其他鱼的关系为中性或负）。体型大小也与心率显著负相关，尽管影响程度较小，并且可能在生物学上不显著（表 2）。




表2. 广义最小二乘法回归（R 语言 nlme 包中的‘gls’函数）对安大略省锡登纳姆河的奇努克鲑鱼（大麻哈鱼属的一种）在产卵洄游期间的心率进行建模。该模型在线性相关结构中纳入了嵌套在个体内的时间因素，以解释模型残差中的时间自相关。




图4. 小提琴图描绘了安大略省锡登纳姆河的人工孵化场（n = 5）和野生（n = 7）奇努克鲑鱼（大麻哈鱼属的一种）在产卵洄游期间的心率（p < 0.01）。




图5. 安大略省锡登纳姆河的个体人工孵化场养殖和野生奇努克鲑鱼（大麻哈鱼属的一种）在产卵洄游期间水温与心率之间的线性关系（灰色阴影为 95% 置信区间）（p < 0.01）。


四、讨论
在产卵洄游期间，使用心率生物记录仪对自然环境中自由游动的雄性奇努克鲑鱼进行了监测。研究人员观察到，人工孵化场来源和野生来源的鲑鱼在心率方面存在显著且值得注意的差异，包括野生鲑鱼的静息心率更低、整体心率更低以及心率范围更高。我们的研究结果表明，在产卵洄游期间，野生鱼的心脏表现优于人工孵化场养殖的鱼，这意味着人工孵化场的养殖条件可能会对心脏功能产生终身影响。研究人员还发现，心率在昼夜和季节时间尺度上的变化与水温的变化一致。除了确定各种因素对心率的影响，包括来源、温度、流量和叉长之外，这项研究还增加了对奇努克鲑鱼基本心脏生理学的了解。


01. 奇努克鲑鱼在产卵洄游期间的心率响应
据我们所知，这是第一项在成年奇努克鲑鱼溯河产卵洄游期间，对其原位心率响应进行研究的实验。在本研究中，奇努克鲑鱼在被标记后平均存活并被监测了 7.4 天，而且记录仪植入对寿命的影响似乎并不严重。弗雷泽河的红大马哈鱼在植入心率记录仪后，在产卵地的寿命为 7.2 天 。同样，针对该奇努克鲑鱼种群的寿命 - 洄游时间模型估计，在本研究使用的标记日期内，雄性鲑鱼在通过米尔大坝后，寿命应该约为 9 天 。有几项研究试图在自然环境中研究太平洋鲑鱼的心率 ，不过大多数研究是在圈养环境中使用心率记录仪 。与其他研究相比，尽管不同研究在物种、性别、水温和实验室条件方面存在差异，但锡登纳姆河奇努克鲑鱼的静息心率、峰值心率和心率范围似乎都在太平洋鲑鱼的正常范围内 。然而，如果我们在没有外部刺激且水流速度较低的暂养池中测量静息心率（如同先前的实验室研究那样），绝对静息心率可能会比这里观察到的更低。此外，我们的研究可能没有让被标记的鲑鱼在手术后恢复到真正的 “静息” 水平，因为先前的研究表明，心率恢复到静息水平可能需要超过 24 小时 ，甚至长达数天 。与先前在圈养环境中进行的将 “恢复” 视为恢复到静息水平的研究不同，积极洄游的鱼（如本研究中的鱼）不太可能恢复到真正的静息心率水平。因此，在本研究中，我们将恢复定义为恢复到日常心率，这在标记后的最长 6.4 小时内发生，而且对于许多鱼来说，在标记后的几个小时内就发生了。虽然理论上鱼在野外恢复到静息水平可能需要多长时间尚不清楚，但我们认为，与圈养环境相比，在自然环境中恢复可能更快，因为暂养对鱼来说可能会有压力（例如，水质条件不佳、活动受限 ）。还应该注意的是，我们不能确定在我们的研究中是否测量到了绝对最大心率，因为没有对鱼进行标准化测试（例如，通过追逐或游泳方案）来使其达到最大游泳速度，而且在太平洋鲑鱼中已经记录到了更高的峰值心率 （表3）。尽管如此，在这里进行的浅水、高流速的洄游似乎有时会引发接近最大的有氧游泳努力。然而，我们主张进一步努力在自然环境中测量心脏参数，以提高这些测量的生态相关性。此外，我们的研究进一步证明，个体鱼之间心率范围的差异似乎是由静息心率的变化（而不是最大心率的变化）驱动的。先前对虹鳟鱼（大麻哈鱼属的一种）的研究表明，较高的静息心率会导致较低的心率范围 。




表3.记录了不同温度范围内各种太平洋鲑鱼物种和种群的静息心率、峰值心率和心率范围。


02. 人工孵化场养殖的鲑鱼和野生鲑鱼在心率方面的差异
尽管仅对少数人工孵化场来源和野生来源的鲑鱼进行了心率监测，而且每条鱼都有独特的洄游经历（例如，手术的严重程度、移动的时间、精细的位置、寿命等），但在这些群体之间还是观察到了有趣的差异。与野生鱼相比，人工孵化场养殖的鲑鱼心率范围更低，心率变化更小，而且静息心率往往更高。有许多潜在的机制可能导致人工孵化场养殖的鲑鱼和野生鲑鱼在生活史上的这些差异，进而导致心率方面的差异。首先，被选用于人工孵化场繁殖后代的亲鱼，通常是在洄游途中采集的，否则它们可能无法成功完成洄游和产卵 。如果心脏表现是洄游和产卵成功的重要决定因素 ，并且人工孵化场人为地提高了心脏表现较差的鱼的产卵成功率，这就可以解释为什么返回的人工孵化场养殖的鱼心脏表现较低。研究人员研究了从眼点卵阶段到成年阶段在相同条件下养殖的成年野生和人工孵化场养殖的大西洋鲑（Salmo salar）的最大心脏功能，发现两组之间的心率没有差异。这个 “共同园圃” 实验表明，对亲鱼的人工选择并不是导致两组之间心率差异的原因，不过这肯定会因特定人工孵化场的亲鱼选择实践而有所不同。或者，人工孵化场养殖条件和野生养殖条件之间的差异，可能会导致在心脏形态和心脏表现方面的选择机制改变或表型可塑性变化。与在野外经历的条件相比，圈养养殖的鱼通常处于更加单一的条件下（例如，恒定的温度、水流和食物供应，没有捕食者）。锡登纳姆河孵化场的鲑鱼是在自然温度条件下养殖的（溪水被引到孵化场），但没有接触捕食者，并且使用定时喂食系统进行喂食。这些条件可能会导致人工孵化场养殖的鱼在生理、形态和行为方面产生差异 。与野生鲑科鱼类相比，人工孵化场养殖的鲑科鱼类的心脏形状异常，其特征是心室比野生的更圆，这是更喜静的鱼类物种的典型特征 。圈养养殖的鲑科鱼类心脏周围的脂肪沉积也往往更多，并且存在心脏畸形 。心脏畸形可能会导致心脏和游泳性能下降 。尽管在本研究中我们没有量化心脏形态，但人工孵化场养殖的鲑鱼在心脏表现方面存在差异，并且与野生鲑鱼相比，它们向上游游到产卵地点的距离更短。一项对挪威南森河的大西洋鲑（Salmo salar）的研究发现，有证据表明，与养殖鲑鱼相比，1 岁以上的野生鲑鱼日常心率更高，2 岁以上的野生鲑鱼心率更低 。同样，1 岁以上的人工孵化场养殖的褐鳟（Salmo trutta）在遇到捕食者时，其心率升高幅度比野生鱼更大 。很少有研究比较野生和人工孵化场养殖的成年鲑科鱼类的心率，以研究心率差异在整个生命周期中存在的程度。然而，从研究人员的研究中可以得出一些相似之处，他们研究了在持续低流量条件（类似于人工孵化场）或可变流量条件（如在野外）下适应海水的奇努克鲑鱼心脏功能的可塑性。在持续低流量条件下饲养的奇努克鲑鱼静息心率更高，心率范围更低，并且往往比先前在可变流量条件下饲养的鱼更快地达到心率平稳状态。

有充分的记录表明，人工孵化场养殖的鲑科鱼类的繁殖成功率通常低于野生鲑科鱼类 。这表明，仅仅在圈养环境中养殖 1 年就会导致终身适应性的持久变化。有大量证据表明，成年人工孵化场养殖的鲑科鱼类和野生鲑科鱼类在形态、生理和行为方面存在差异，这可能导致了适应性的下降 。然而，据我们所知，我们的研究是第一项发现人工孵化场养殖的鲑鱼在产卵洄游期间心脏表现不如野生鱼的研究。这可能为人工孵化场养殖的鲑科鱼类洄游和繁殖性能下降提供了一种机制性的生理学解释，不过对其他心脏性能指标（例如，心输出量、每搏输出量）的研究将有助于巩固野生鲑鱼和人工孵化场养殖的鲑鱼在心脏表型方面存在差异的证据。值得注意的是，奇努克鲑鱼在锡登纳姆河的溯河洄游相对较短，远不如在哥伦比亚河、弗雷泽河或育空河等水系中的洄游那么困难，在那些水系中，鲑鱼可能要溯河洄游 1000 多公里才能到达出生地产卵地。因此，我们可以预测，在更艰苦的洄游过程中，这种差异会更加明显。无论如何，我们的研究基于大量证据表明，人工孵化场养殖的鱼不能完全等同于野生鱼。


03. 温度对心率的影响
洄游的成年奇努克鲑鱼的心率往往随着水温的升高而增加，这与以下事实相符：随着温度升高，代谢率和组织对氧气的需求增加，这就需要增加心输出量，而在硬骨鱼类中，这主要是通过提高心率来实现的，其次是通过调整每搏输出量来实现 。例如，红大马哈鱼的峰值心率随着温度升高而逐渐增加（在 16°C 时最低，在 21°C 时最高） 。超过最适温度后，心血管系统崩溃很常见，这主要是由心率范围不足导致的 。虽然锡登纳姆河的水温没有超过该物种的最适温度，但有大量证据表明，不同种群根据当地条件对温度的耐受性存在差异 。随着温度升高，像奇努克鲑鱼这样在洄游期间依赖足够的心脏范围来克服氧气限制的物种，其性能可能会受到影响 。


五、结论
目前这项对奇努克鲑鱼在产卵洄游期间心率响应的研究，加深了我们对自然环境中自由游动的野生和人工孵化场养殖鱼类心脏功能的理解。人工孵化场养殖的鲑鱼静息心率较高，进而心率范围较低的趋势表明，人工孵化场养殖的奇努克鲑鱼在洄游期间的心脏能力较低，这可能会降低它们的洄游能力，从而降低其终身适应性 。研究发现，水温与鲑鱼的心率呈正相关 ，随着气候变化导致淡水温度升高，这可能会对鲑科鱼类产生影响 。我们鼓励研究人员进一步探索这里发现的各种关系，特别是人工孵化场养殖的鲑鱼在产卵洄游期间的心脏表现与野生鲑鱼不同这一观察结果。我们的研究为太平洋鲑科鱼类的洄游性能提供了一种机制性的理解，并为在代表更艰苦洄游的生态系统中进行类似研究创造了机会。


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长长的路

微流控芯片：微流控生物传感器
生物传感器应用允许使用基于酶、纳米酶、抗体或核酸（DNA或RNA）的分析进行护理点测试。该领域的预期发展包括使用生物相容性材料制造微流控装置的技术的优化。这些发展将增加生物医学的通用性，降低诊断成本，并加快微流控技术的诊断时间。接下来我们讨论的重点是近年来微流控装置的生物传感器发展。
近年来，基于微流控的生物传感器的几个优点使其在测定和检测各种生物颗粒方面具有独特的方法。基于连续微流控的生物传感器为我们提供了用最少的试剂对少量生物分子进行快速分析的机会，从而在单个平台中以最少的成本产生少量的副产物。基于生物分子的微流控生物传感器根据所使用的生物元件的类型分为四组，包括基于酶的、基于纳米酶的、抗体的和基于核酸的生物传感器。


1.基于酶的微流控生物传感器
酶是自然界中的蛋白质，与非催化剂反应相比，已知可提高105至1017的反应效率。生物传感器嵌入酶通常属于氧化还原酶类，可用于催化氧化还原反应。酶是完美的生物传感器，因为电化学监测通常用于检测其周转。
自1962年Clark和Lyon等人引入第一个酶生物传感器以来。酶由于其固有的功能特性，如高选择性、生物催化活性和精确的酶-底物相互作用，已被用于多种生物传感应用。通过利用这些特征，基于酶的生物传感器构成了对几种生物标志物的连续监测和快速、准确的分析。由于自动化、小而稳定的传感面积和多重功能，它们通常与微流控平台耦合、。在这些平台中，酶的可靠性、长期稳定性和可重复使用性是主要关注的问题。酶固定化是应对这些挑战的最关键技术之一。酶在换能器表面和微通道上的固定策略已在文献中得到广泛综述。大多数固定化方法依赖于酶的吸附、共价键、交联和包埋。吸附是直截了当的。离子、氢键和范德华力等物理相互作用负责固定化，而不会破坏酶的基本结构。然而，共价键更为复杂。它需要酶的表面基团和表面之间的强烈相互作用。固定化也可以通过在酶之间形成强共价键来进行。交联方法通过利用交联剂进行固定形成三维酶复合物。最后，酶可以被封装在有机或无机聚合物基质中，以维持酶的结构稳定性并减少渗漏。葡萄糖水平测量主要由这种类型的微流控生物传感器进行。在这些系统中，广泛使用的酶是葡萄糖氧化酶（GOx），因为它具有高特异性、低成本和对pH和温度的持久性。这些优势使GOx成为微流控生物传感器的有效酶，用于监测血液和唾液、眼泪和汗液等非侵入性液体中的葡萄糖水平。最近，Sun等人首次开发了一种微流控生物传感器，用于从单滴这些非侵入性液体中监测葡萄糖水平。这个完全集成的纳米电子系统由一个无泵、柔性的微流控酶系统（称为iez-Slice）组成，再加上一个定制的可重复使用的恒电位仪（称为ie zBar），用于信号采集和无线传输。在该微流控平台中，为了实现包括眼泪、唾液和汗液在内的各种原始生物流体中的葡萄糖测量，具有分级结构的三维碳质纳米球网络气凝胶（3D-CNA）由于其更高的电催化能力而被用作葡萄糖氧化酶电极底物。此外，使用由高浓度缓冲粉末负载的Kimwipes（HBP-KWs）制成的微通道提供了从眼泪、汗液和唾液中进行的独特稳定的葡萄糖测量。由于HBP的性质，这种微通道迫使生物流体在流入时保持相同的pH值和高离子强度。他们指出，与HBP-KWs微通道一起，这种基于酶的微流控生物传感器准确分析了0.30μL原始非侵入性生物流体样品中的葡萄糖，其r值高得多（≥0.96）。对葡萄糖副产物乳酸水平的监测对运动员和高强度工作者来说非常重要。此外，乳酸水平被标示为组织缺氧的最佳标志物。最近，Shitanda等人开发了一种用于汗液乳酸水平跟踪的微流控传感系统。他们在甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）的烯烃的帮助下，通过共价键合方法将乳酸氧化酶（LOx）固定在MgO模板碳丝网印刷电极上。该电极配置提供了高表面积以获得高响应读出。然后，将该电极集成到具有八个汗液收集通道的微流控平台中，以避免湍流和空气捕获，并引入半径为10mm的腔室。监测另一种生物标志物尿素的水平，可以提供有关肾脏和肝脏健康的信息。因此，文献中存在许多基于脲酶水解尿素原理的微流控平台。此外，监测肾脏健康的肌酸酐水平是基于酶的生物传感器的首要应用之一。Tzianni等人开发了一种用于尿肌酐测量的智能手机耦合纸基sim卡型生物传感器。将肌酸脱氨酶固定在pH响应性共聚物PMMA-co-PMAA上，并展示了三种导电电极配置。该系统已成功安装在sim卡中。基于相同的原理，各种酶微流控纸基分析设备彻底改变了微流控在生物医学应用领域的应用。这种改进进一步提高了纸结合酶微流控系统分析性能的灵敏度和选择性。此外，由于其协同效应，酶固定化纸表现出进一步的机械和化学稳定性。尽管如此，这种结合增加了使用寿命和酶的稳定性。基于酶的纸张微流控系统μPADs提供了一种高度柔性、薄且具有成本效益的纤维素基质。此外，该纸具有高表面积体积比的隐含毛细管功能，使用户能够装载各种酶和标记物。此外，微流控纤维素纸的表面可以通过归因于样品和检测的两个区域方便地调节微流控通道（图1）。


图1：用于细胞损伤分析的基于液滴的微流控平台。（a） 该装置连接到细胞培养平台，用于同时定量生化分析物。（b） 实现三种不同酶测定的概念表示。
在过去的十年中，通过利用微流控，加速了对侵入性和非侵入性生物流体中同时存在的生物标志物的多重分析。例如，Bhide等人开发了一种酶促低体积微流控平台，该平台可以同时分析三种生物标志物——低体积汗液（1-5μL）中的酒精、葡萄糖和乳酸水平。监测血清中的游离氨基酸可以提供包括癌症在内的几种疾病状态的重要信息。
Kugimiya等人开发了一种层压纸基分析装置（LPAD），利用氨酰基tRNA合成酶（aaRS）分析系统来测量组氨酸、色氨酸、甘氨酸和赖氨酸水平（图2）。它包括一个连接到四个酶反应区的样品点，每个酶反应区含有一种氨基酸类型的特定tRNA合成酶和四个检测区。检测区和反应区之间通道的性质和尺寸规定了反应混合物的培养时间。在检测区中，使用图像扫描仪对由钼蓝反应引起的比色信号进行量化。在另一项研究中，依靠多层微流控平台中基于酶的比色读数，测量了汗液中的氨和乙醇浓度。在该平台中，超吸收性聚合物（SAP）泵和毛细管爆裂阀集成在一起，用于混合目的，以及增加反应动力学控制。除了监测患者的健康状况外，这些类型的微流控传感器还用于监测和表征微流控细胞培养系统。在一项有趣的研究中，Cedillo Alcantar等人为此开发了一种基于液滴生成技术的自动化微流控平台。为了强调应用，他们对包括肝细胞球体的微流控细胞培养平台的葡萄糖、胆汁酸和乳酸脱氢酶（LDH）进行了同时分析。为了避免固定化时酶活性降低的问题，他们在整个测量过程中注入了所需的酶。在自动气动阀的帮助下，首先将酶与底物混合，然后将其封装在油包水液滴中。在每个微小的液滴（<0.8 nL）中，进行离散的酶测定，并根据比色和荧光读数对结果进行量化。


图2：（a） 层压纸基分析装置（LPAD）的制造表示，用于通过样品特异性氨酰基-tRNA合成酶的反应同时定量几微摩尔至100μM范围内的色氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸水平。（b） LPAD的详细信息。纸张性质和检测区与反应区之间通道的尺寸规定了反应混合物的培养时间。
2.基于纳米酶的微流控生物传感器
纳米酶是一种人工纳米材料酶，不仅模拟酶的活性，而且由于其令人印象深刻的特性，与天然酶相比具有优势。与天然酶相比，它们易于大规模生产，成本低廉，储存时间长，并能承受高pH和高温等恶劣条件。自2007年首次引入以来，纳米酶代替酶在生物传感器中的应用势头越来越大。Gao等人首次发现了磁铁矿（Fe3O4）类似于天然过氧化物酶的有趣的酶模拟性质。他们提出了一种新的免疫测定法，用H2O2Fe3O4代替辣根过氧化物酶（HRP）来催化各种过氧化物酶底物的氧化。在接下来的几年里，发现了其他具有类似过氧化物酶性质的纳米材料，如金属和金属氧化物、金属-有机框架（MOFs）和碳基纳米材料。此外，据报道，许多纳米材料可以模拟其他酶的活性，包括氧化酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶（SOD）。
随着模拟酶纳米材料的发现，它们在微流控生物传感器中执行酶功能的应用得到了加速。考虑到微流控葡萄糖生物传感器的突出研究领域，纳米酶被有效地用于比色、电化学和荧光葡萄糖测量。Gomez等人首次在微流控纸基分析装置（μPAD）中使用支撑的金属-有机框架（MOF）模拟过氧化物酶的活性，并使用小样本体积（10μl）的尿液和血清测量葡萄糖水平。另一个μPAD是基于过氧化物酶模拟铂纳米颗粒（Pt-NPs）设计的，用于同时检测尿酸和葡萄糖。过氧化氢本身是一种重要的分析物，也是催化氧化反应的重要产物或底物。因此，利用纳米酶的各种微流控生物传感器包括Au@PtNP/开发了用于H202测量的GO、氧化石墨烯金和氧化铈纳米片（NSs）。纳米酶也被用于癌症的护理点（POC）诊断。最近，Liu等人开发了一种电化学/视觉微流控平台，用于基于共价-有机框架的纳米酶的过氧化物酶模拟活性的嗜铬细胞瘤循环细胞（PCC CTCs）的灵敏检测(COF@Pt).
3.基于抗体的生物传感中的微流控
基于抗体的微流控生物传感器基于各种单克隆抗体的固定化作为快速检测机制。使用抗体作为生物传感器的优点是，无需事先纯化步骤即可检测免疫原。然而，重组技术的最新发展使产生fab片段成为各种通用抗体的主要抗原结合位点成为可能。传统免疫测定技术的局限性已经与微流控装置相结合而被克服。在最近的疫情中，各种基于微流控的便携式免疫测定条为使用咽拭子检测严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 IgG/IgM/抗原提供了准确、快速和方便的方法。在这种情况下，微流控免疫测定依赖于病毒蛋白与传感器电极上固定的抗严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型抗体的相互作用，该传感器具有检测电流变化的能力。探测器通常涂有各种材料，如氟掺杂的氧化锡电极（FTO）或丝网印刷的碳电极（SPE）或金纳米颗粒AuNPs或石墨烯，因此它们在抗原/抗体相互作用时充当导电性变化的指示剂。
基于DNA的微流控生物传感器采用靶向DNA片段的扩增，然后在单个平台中对所获得的固定互补靶序列的序列进行DNA杂交。通常需要在凝胶基质上进行单独扩增和碱基配对的技术通过接收理化信号的相关变化，利用方便的检测方法集成到单个工具中。
目前，有三种主要的微流体生物传感器被开发用于检测核酸：PCR、（CRISPR）/簇状规则间隔短回文重复序列和等温扩增。几个研究小组报告的微流控集成qPCR方法具有高通量方案处理的优势，允许进行大规模定量分析，包括在单个芯片平台中进行制备和检测。Cojocaru等人最近推出的一种基于PCR的微流控系统是一种用冻干探针和引物功能化的一次性芯片，每次反应可提供1.2μL体积的快速结果（不到30分钟）。在等温扩增中，PCR的基本部分热循环器被培养箱或水浴集成微流控设备所取代。开发了几种类型的基于微流控的等温扩增，包括滚圈扩增（RCA）、重组酶聚合酶扩增（RPA）和环介导的等温扩增（LAMP），它们非常有效和准确。Ramachandran等人设计了一种基于微流控的CRISPR，将CRISPR–Cas12酶和引导RNA引入设备，与选定的靶DNA结合并切割。然后，活性化合物随机切割被探测的单链DNA标记的荧光猝灭基团。在这种方法中，通过控制从电场变化中获得的梯度来分析CRISPR测定，随后在微流控设备内导航靶DNA、报告子和Cas12–gRNA。这项技术被称为等载体电泳（ITP）增强的基于微流控的CRISPR分析，可以在不到35分钟的时间内检测目标核酸RNA。
在过去的几十年里，微流控设备取得了重大进展，用于从诊断到疾病建模的各种应用。由于生物相容性材料在微流控（MF）装置的生产中的使用以及许多生产技术的发展，近年来它们在生物应用中的应用已经变得广泛。微流控系统的应用最初集中在食品和药物测试上。然而，随着时间的推移，对以微流控为特征的小型生物医学工具的需求已经扩大。许多传统的实验室诊断方法，如RT-PCR和其他分子分析方法，已经使微流控系统成为非常强大的工具。其他应用，如DNA检测和蛋白质检测，已经导致了基于微流控的传感器试剂盒的开发和实施。表面声波（SAW）传感器将质量和密度变化转换为电信号，是生物标志物检测的一些最有前途的工具。微流控设备将在未来的生物医学应用中得到更多的应用，并将降低诊断成本和加快诊断时间。