流式细胞术的基本原理？

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流式细胞术很常见，操作也不算复杂，具体原理是什么

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大力水手

1. 介绍

流式细胞术是一种在细胞逐个通过检测点（通常为一束激光）时，对其化学和物理特性进行测量的技术。当细胞将激光散射至不同方向（前向或侧向）时，可据此测定细胞的固有特性，例如相对细胞大小与胞质复杂性。以人体全血为例，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞正是由于对激光的散射模式存在差异而得以区分。



图1. 典型的人类全血溶解后的光散射图谱。

现代流式细胞仪不仅能检测细胞固有属性，还能测定多种外源性细胞特征，包括细胞表面或胞内标志物表达、核酸含量、酶活性等指标。为解析这些细胞特性，需使用荧光试剂（如荧光染料偶联抗体）。此类试剂具有特异性的光散射特征，可在不同荧光通道中被独立检测。
流式细胞术的独特优势在于能以极高速度（每秒10,000个events）对细胞或微粒水平的荧光信号进行实时分析。当荧光标记的细胞或微粒通过光路时，其携带的荧光探针被激发，系统随即捕获发射光信号。



图2. VioBlue、FITC与APC染料的激发与发射光谱

该技术广泛应用于细胞生物学的基础研究与临床实践。在科研领域，其应用涵盖免疫学、移植医学、血液学、神经科学、干细胞研究、肿瘤学、细胞生物学、分子生物学、药物研发、系统生物学、海洋生物学、微生物学、病毒学及生物工艺开发等方向。在临床层面，流式细胞术主要应用于体外诊断、临床试验研究、治疗后患者免疫监测等场景。部分医疗机构还通过该技术对移植供受体细胞进行表型分析，以降低移植后不良反应的风险。
• 多色免疫表型分析
• 基于碘化丙啶（PI）与膜联蛋白V偶联物的细胞活力评估及凋亡检测
• 胞内细胞因子与转录因子检测
• 应用MACS®细胞因子分泌检测技术定量细胞因子分泌水平
• 采用PI或溴脱氧尿苷（BrdU）的细胞周期分析
• 微囊泡分析
• 细胞绝对计数
• 钙离子流动态监测
• 氧活性物质（H2DCFDA）与一氧化氮活性物质（DAF-FM二乙酸酯）检测
• 基于CFSE或CMFDA染料的细胞增殖追踪
• 荧光报告蛋白（GFP、CYP、YFP、tdTomato、mCherry、RFP）表达分析
• 病毒颗粒、细菌及线粒体检测
2. 流式细胞仪的机器组成

美天旎生物（Miltenyi Biotec）的MACSQuant® 流式细胞仪基于流体、光学与电子系统的高度集成化设计。
• ​流体系统：通过液流控制使细胞或微粒定向通过激光检测路径
• ​光学系统：由一系列光学滤光片与反射镜组成，将细胞/微粒发射的特定波长光信号引导至检测器进行放大
• ​电子系统：作为光学与计算机的接口，将放大后的光信号按比例转换为电压，实现数据可视化
2.1 流体系统

该系统采用流体动力学聚焦技术，确保细胞/微粒单行排列通过激光路径。鞘液在恒定压力下流经流动室，细胞被注入鞘液中心层。基于层流原理，细胞样本与鞘液保持同向流动但保持分离。鞘液与细胞样本之间的压力差决定了样本流通过流动室时的宽度。当荧光标记的细胞/微粒逐个经过激光时，其散射光与荧光信号被同步检测。



图3. MACSQuant® 仪器的流体动力聚焦示意图。

针对需高分辨率的检测（如细胞周期分析），推荐采用低流速模式以形成狭窄样本流，提升单细胞信号解析度；常规免疫表型分析则对流速无特殊要求。需注意：​仪器event rate设置不得超过10,000/s，以避免信号重叠导致数据失真。
2.2 光学系统

滤光片与分色镜
当激光激发细胞或微粒携带的荧光标记物时，这些试剂会发射特定波长范围的光信号。使用多色荧光染料组合时，需确保各试剂的发射光谱互不重叠。MACSQuant®利用各种光学滤光片和分色镜将特定波长的光引导至相应的荧光探测器，由此建立荧光检测通道。
光学滤光片
不同类型的滤光片决定了可进入荧光通道的波长范围，根据光学特性分为：

• ​长通滤光片（Long-pass, LP）​：允许≥设定波长的光通过（如LP 750表示750 nm及以上波长透射）
  
• ​短通滤光片（Short-pass, SP）​：允许≤设定波长的光通过（如SP 500表示500 nm及以下波长透射）
  
• ​带通滤光片（Band-pass, BP）​：仅允许特定波段的光通过（命名规则为BP中心波长/带宽，例如BP 525/50表示透射500-550 nm光）
  

图4. 长通、短通及带通滤光片功能示意

分色镜其功能与滤光片相似，但采用45°倾斜安装​（滤光片为垂直安装）。当特定波长光无法穿透分色镜时，会被90°反射至其他检测器，实现多通道信号分选。
MACSQuant流式细胞仪整合三组激光器与多级滤光系统，可构建14个独立荧光通道及2个散射光通道。
光子探测器——光电倍增管（PMT）​
每个荧光通道的光信号由光电倍增管（PMT）​进行检测，并产生电流。PMT通过以下机制工作：

• ​信号放大：对荧光素发出的微弱光信号进行指数级放大
  
• ​电压调控：施加电压越高，信号放大倍数越大，检测到的平均荧光强度（MFI）越强
  
• ​信号转换：将放大后的光信号转换为电子系统可识别的电压脉冲
  

2.3 电子系统

流式细胞仪的电子系统负责将光信号转换为成比例的电子信号（电压脉冲），通过模数转换器（ADC）的位深进行数字化处理，并与计算机交互完成数据传输。
MACSQuant®系列采用全数字化流式检测技术，其模数转换在信号检测与放大阶段同步完成，具备以下优势：
• ​多维度信号解析：电压脉冲的高度、宽度与面积均可作为量化参数
• ​灵活补偿调节：光谱重叠补偿在信号数字化后实施，支持实验后重复调整
• ​多通道触发阈值：可在任意检测通道设置信号触发阈值
• ​负值信号保留：零值或负值的荧光信号可被准确记录并于绘图选项中显示
电压脉冲
当荧光标记细胞通过激光路径时：

• ​起始阶段：细胞边缘进入光路，荧光素开始激发，PMT启动电压脉冲生成
  
• ​峰值阶段：细胞完全进入光路，荧光发射达到峰值，对应脉冲最高幅值
  
• ​衰减阶段：细胞离开光路，荧光信号减弱，脉冲随之终止
  

图5. 电压脉冲与细胞位置的时间关联曲线

模数转换技术
模拟信号根据ADC的位深度被转换成数字信号，以便显示数据。MACSQuant®搭载16位模数转换器（ADC）​。针对脉冲面积参数测量，可通过算法优化实现18位处理精度，将信号解析为超过253,000个数据单元。此项技术使荧光强度能够以五数量级对数刻度精准呈现。
3. 流式细胞术数据可视化

流式数据中，每个测量的光学参数的值可以以多种方式绘制。这些图表可以是一元的（直方图）或二元的（散点图）。
3.1 一元图——直方图

直方图以单个光参数（荧光或散射）​为横坐标，​event数为纵坐标，展示细胞群体在该参数上的分布特征。每个检测event的信号强度值均存储于数据文件中，随着event累积，曲线形态直观反映细胞群体在不同信号强度区间的丰度变化。直方图的信号强度轴（横轴）​从左至右递增，即左侧细胞群体信号较弱，右侧群体信号较强。



图6. 荧光强度-event数直方图

3.2 二元图——散点图

散点图通过二维坐标系同时呈现两个光参数的关联性。每个event的位置由x轴与y轴对应的信号强度共同决定，信号特征相似的细胞会聚集成簇，对应特定细胞亚群。此类图形可揭示细胞群体间的表型相关性，例如CD4+ T细胞与CD8+ T细胞在CD3/CD28双标记分析中的分布差异。



图7. 双荧光信号强度点图。在该点阵图中，使用 FITC 和 PE 结合物抗体对细胞进行了分析。图中显示的细胞群要么对两个参数都呈阴性（左下，LL），要么对一个参数呈阳性（UL 和 LR），要么对两个参数都呈阳性（UR）。

3.1.3 二元图——密度图

密度图在散点图基础上，通过颜色梯度或等高线突出高event密度区域。每个细胞仍以点表示，但密集区域的叠加效应通过色阶变化可视化，特别适用于大样本量的细胞分布解析。密度图能清晰呈现主要细胞群体的聚集中心，同时显示边缘稀有event的存在，适用于免疫细胞分型或肿瘤异质性研究。



图8. 细胞亚群分布密度图，描述了群体中细胞的分布情况。在密度图中，红色代表细胞群中event的最高密度。随着密度的降低，颜色从黄色过渡到绿色和蓝色。