免疫组化发展历程：从探索到精准医学的跨越

临床医师

免疫组化，作为现代医学和生物学研究中的关键技术，其发展历程见证了人类对生命奥秘不断探索的脚步。从最初对抗体 - 抗原反应的懵懂认知，到如今成为精准医学诊断和研究的重要工具，免疫组化的每一步发展都凝聚着无数科研人员的心血与智慧。

一、抗体发现
抗体的发现堪称生命科学领域的一份珍贵礼物。在人类与疾病抗争的漫长历史中，科学家们逐渐认识到抗体在免疫反应中的关键作用。随着研究的深入，人们发现抗体 - 抗原反应会产生沉淀，这一现象引发了科学家们对抗体本质的深入思考。Heidelberger，这位现代免疫学之父，在 1920 年基于氮检测原理证明了抗体 - 肺炎球菌多糖复合物中含有氮，进而推论抗体可能是一种蛋白质。尽管 Heidelberger 的方法存在一定局限性，无法准确区分检测到的氮来源于抗原还是抗体，但他的探索为后续研究奠定了基础。

随后，Heidelberger 和 Kendall 发明了染色方法，通过使用紫色偶氮染料标记沉淀鸡蛋白蛋白，当特异性抗体添加后，抗原 - 抗体沉淀复合物第一次有了颜色，这一突破使得对抗原 - 抗体结构、结合机制的研究得以进一步深入。1934 年，Marrack 提出大部分抗原是多价的，抗体是二价的，他首次在抗体上标记染料，制造了红色标记的前伤寒和抗霍乱抗体，为免疫组化技术的发展迈出了重要一步。

二、标记技术的兴起

标记技术的出现，如同为免疫组化插上了翅膀，使其发展进入了广阔天地。早期，研究人员使用常规染料对抗体进行标记，但在使用过程中发现存在信号弱的问题。1941 年，微生物学家 A.H.Coons 首次将一种荧光素（异氰酸荧光素）标记在抗肺炎球菌抗体上，可在紫外照射下示踪小鼠组织中的肺炎球菌，极大地增强了标记抗体的信号，开启了免疫组化荧光标记的大门。

然而，异氰酸荧光素标记方法操作困难，效果不稳定，如组织在紫外照射下容易有蓝色和红色背景干扰。经过不断改进，1958 年 Riggs 等制备了稳定的荧光素异硫氰酸酯（FITC）用于标记抗体，实现了稳定性与特异性的增强。FITC 标记原理是 FITC 的氨基 - NH2 与 FITC 中的碳酰胺基 - C = S 相结合，这种标记方法在免疫组化中得到了广泛应用。

在抗体结构研究的基础上，人们发现 IgG 可变区有两个可以与抗原结合的区域，因此标记可以在恒定区进行。FITC 直接标记在抗 IgG 分子的 Fc 片段（恒定区），即直接法，这种方法使得抗体可以直接与组织或细胞中的抗原发生反应，也被称为一步标记，至今仍在某些领域被使用。




三、技术演进

直接法虽然简单直接，但存在需要高效价的一抗且成本高的问题。为解决这一难题，研究人员将一抗作为抗原看待，先用一抗 IgG 去免疫体型较大的动物，获得较多的 Anti - IgG 抗体，然后在二抗上标记，实现放大效果，这就是间接法。

随着荧光标记免疫组化的发展，到 20 世纪 60 年代，荧光依然在使用，同时也出现了多种常用荧光素，如异硫氰酸荧光素（FITC）、得克萨斯红（Texas Red）、Cy3、Cy5 等。然而，荧光标记抗体对实验设施要求较高，需要荧光显微镜，且存在荧光淬灭等问题。

为在常规实验条件下实现免疫组化，19 世纪 60 年代中叶，酶标技术应运而生。酶与一抗或二抗标记，结合后可以特异识别自身底物，颜色产物可在普通显微镜下观察。最初，人们使用碱性磷酸酶作为标记酶，但实验结果不稳定。1967 年，研究人员找到稳定的辣根过氧化物酶，并对其偶联技术进行描述。

酶标技术不断发展，同时免疫电镜技术也取得进展，放射性和金属标记被用于抗体标记，如 1959 年 Singer 首先建立了用铁蛋白标记抗体的方法，使人们在电镜下对细胞抗原进行精确定位。但酶标技术早期也存在一些问题，如辣根过氧化物酶不能标记所有的抗体，无法解决抗体去除等问题。

为解决这些问题，研究人员提出了三明治法（过氧化物酶三步法），引入用过氧化物酶抗 - 氧化物复合物，原理如下：相当于增加一个过氧化物酶标记点，提高了敏感性。在这一过程中，没有使用化学偶联标记，唯一的缺点在于方法的复杂性提升了敏感性和特异性。

1983 年，PAP 技术（Peroxidase - antiperoxidase，PAP）出现，其原理与上述方法类似，但进一步优化了检测过程。然而，由于抗原 - 抗体反应在洗涤过程中抗体被洗脱的可能性，导致检测灵敏性降低。1981 年，人们设计了利用生物素和卵白素之间高度亲和的特点，产生了亲和素 - 生物素复合物法（avidin - biotin complex method，ABC 法），该方法在国内免疫组织化学实践中主导了 20 多年。




此后，在 ABC 法的基础上，又发展了 SP、LSAB 及 SABC 法，这些方法的主要特点是用链霉菌卵白素或生物素 ABC 法中的卵白素，由于链霉菌卵白素或生物素几乎不与组织中的内源性凝集素样物质发生非特异性结合，因而产生低背景、高放大与检测效果，同时避免了与组织内的内源性生物素相结合而产生非特异染色。

四、展望未来

进入 21 世纪，免疫组化技术继续发展，酶聚合物法在右旋糖酐上用间接法进行染色，其特异性较第一代优于过去的方法，如 EnVision、PowerVision 等方法。关注用作标记物的酶有过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）等。酶与 Ig 均为蛋白质，都有较多的氨基，不能直接用台交联，必须通过一个交联剂（3 - CH2）将它的两个醛基伸出（ - CHO 分别与 IgG 的 NH2 及酶的 - NH2 结合），这样就把不同的蛋白质连接在一起了。

免疫组化技术从诞生到不断发展完善，始终围绕着解决检测灵敏性、特异性以及操作便利性等问题展开。如今，免疫组化已广泛应用于肿瘤诊断、病理研究、药物研发等多个领域，成为精准医学不可或缺的重要工具。随着技术的不断进步，如与分子生物学技术的结合、自动化设备的应用等，免疫组化技术将在未来为人类健康事业做出更大的贡献，帮助我们更深入地理解疾病的发生发展机制，实现更精准的疾病诊断和治疗。






文章来源：免疫组化发展历程：从探索到精准医学的跨越
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