测序小白必看！5分钟搞懂测序数据

青草

01数据的产生


1、测序仪(Hiseq)

HiSeq测序仪由一台高精度的显微光学扫描仪(用于扫描芯片)，一整套的液流和温控系统(用于扩增 DNA)以及计算机软硬件(测序数据获取及处理)组成。


HiSeq使用CCD作为其感光元件。CCD只能感光，不能分辨颜色，因此该机器使用四路 CCD+滤光片来分辨四种碱基。(使用4种荧光染料标记的dNTP，最新的为用两种荧光染料标记的双通道SBS技术以及基于CMOS感光元件的单通道SBS技术。)

TDI线扫描：


和传统相机一拍就是整张照片(面阵)不同，HiSeq 采取的是一种特定的叫TDI的线扫描方式。

2、测序芯片


3、图像处理

1）.tiff

扫描出来的最原始的文件，记录了每个像素点上采集到的光强度。

2）图像文件→光点文件

就是把4种颜色的4张照片组合在一起，变成一张有4种颜色的彩色照片。


4个CCD产生的4张照片，将它们合成首先要解决的是4张照片在空间位置上的匹配问题。软件是通过对4张照片上的亮点相互比对，找到最合适的、匹配的位置。

4、碱基不平衡

碱基平衡，即在测序过程当中，每个循环(A、C、G、T)四种碱基都是比较均匀的存在。如基因组文库。

碱基不平衡文库指的是A+T/G+C≤40%或≥60%的样本，最典型的就是PCR扩增子文库：特点是PCR有特定的起始位点，在一个特定的测序循环中，几乎所有的片段都是同一种碱基，而剩下的3种碱基特别少。

这在反映到测序照片上的时候，就变成一张照片特别亮，光点很多。而其它的三张照片就特别暗，上面的光点就很少。这时候，要软件做空间上的比对，软件就会觉得困难，因为对于那几张暗的照片，软件很难判断上面的光点是否与那张亮的照片上的光点真正对得上。结果，就是判断出来的可靠性变差。最后，就是测序的数据质量变差，有效数据量也会变少。

要解决这个问题，办法是在测序过程中掺入一些碱基平衡的文库。例如掺入全基因组文库，或者Ilumina提供的标准的Phix文库，这些都是碱基平衡文库。

常见的碱基组成不平衡的样本类型比如：甲基化、扩增子、转录组、ChIP、重复序列测序（16S rDNA，功能基因扩增文库……）等等，其中重亚硫酸盐处理后的甲基化样本是碱基组成极度不平衡的，基本没有C，只有A、T、G三种碱基，而T的含量又比正常样本增加几乎一倍。

5、Phix文库

PhiX文库中GC含量约为45%，PhiX DNA就是ΦX174噬菌体的DNA，其基因组的长度大约4kb，其序列已清楚地被测定。

PhiX DNA文库没有Index，所以在样本Demultiplex的过程中，被挪到undetermined的文件中，不会与别的有Index的文库相混。

PhiX的序列是已知的，所以，在测序过程中，仪器会对PhiX的序列进行比对，算出Phasing和Pre-Phasing。(Phasing，一个簇中，有多少比例的DNA是少合成了一个碱基，Pre-Phasing，有多少比例的DNA是多合成了一个碱基。)
样本的碱基越不平衡，Phix文库的比例越高。PhiX可以同时起到两个作用：改善碱基平衡度，作为阳性对照监控测序操作是否成功。
<hr/>02数据质量控制


1、Phasing和Prephasing

1）Phasing

在Illumina的测序过程当中，一个簇大概有5千个到 1万个分子。但是在边合成边测序的过程当中，每一步酶反应，理想情况下，应该这5千个分子都延长1个碱基。


但实际情况，总有少量分子没有完成延长反应。也就是说，总有少量的分子会掉队，我们称这种掉队的现象叫Phasing。

Phasing主要是由于聚合酶活性不足所引起的，由于dNTP经过修饰，天然聚合酶对其活性必然会降低。


掉队的分子，它所发出的荧光信号，和大部队所发出的荧光信号是不一样的。这个循环的次数越多，掉队的分子就越多。所以，测序越到后面，它 Phasing 的分子数就越多。最后，信号的可靠性就越差。

2）Prephasing

在测序过程中，还会有一部分分子会跑得超前，也就是在一个循环中，它延长了2个碱基。其主要原因是dNTP上标记的那个叠氮基团(-N₃)掉了，当其加到合成链的3´端之后，聚合反应不会终止，直到再加上了一个带叠氮基团的dNTP之后，这个聚合反应才停下来。其所发出来的荧光颜色，也是和大部队不一样的。同样也会使信号的可靠性变差。


叠氮基团在常温下不稳定，尤其是3´端的叠氮基脱落后，dNTP的3´端的羟基就会暴露出来。所以其测序试剂盒需要低温保存，测序仪中存放试剂的位置也是控低温的。

在illumina的SBS测序过程当中，Phasing和Prephasing是限制测长的最主要原因。即随着循环不断进行，越来越多的分子掉队，还有越来越多的分子超前。当它们所产生的噪音，掩盖了大部队的信号的时侯，也就是测序开始测不准的时侯。

2、Chastity和Pass filter

1）Chastity

Chastity的定义，就是浓度最高的那个荧光素的量，去除以“它自己与排名第二的荧光素的量的和”，结果大于 0.6 是一个好碱基。



它的意义在于对光点当中荧光素的纯粹程度进行描述。

2）Pass filter

illumina对每个read的质量都要做一个pass filter检验。检验的标准是看前25个碱基当中，有几个是坏碱基。通过pass filter检验的标准是坏碱基数目不超过一个。

这个校验的作用，是去掉一个荧光点中，含多个cluster(read)的数据，留下纯粹的单克隆read，作为合格的数据交给用户。

PF data，指的就是Pass Filter(PF)的数据。而PF 率，则是指Pass Filter的Reads数占总的、测到的 Reads数的比例，它可以从一个侧面反映测序的质量。一般来说，如果上样密度过高，PF率就可能会下降。

3、Quality Score

碱基的质量分数，即Q值，Sanger的定义是通过这个碱基被误判的可能性，换算出以 10 为底的对数，再乘以“-10”得到的这样一个数值。


1）Q30

常说的Q30，就是QV为30时对应一个碱基的可靠性达到99.9%。或者说，它的出错的可能性小于千分之一。同理，我们说Q40，就是指一个碱基的可靠性是99.99%。或者说，它的出错的可能性是万分之一。

2）Q30 比例

而所谓的Q30比例，就是在全部PF数据当中，达到或者超过Q30质量标准以上的数据占所有PF数据的比例。Q30比例可以表征一个测序过程的质量的好坏。一个碱基的质量分数，不是以数字方式，直接记录到最后的FastQ文件的。而是把它的Q值，加上 33，再用ASCII码表转换成一个字母，把这个字母录入FastQ文件。

二、Fastq与FastQC

1、Fastq格式

二代测序平台获得的原始数据为fastq(或为压缩文件fq.gz)格式，包含双端测序的2个read文件，每一个read包含四行内容。



第一行以@开头，后面是reads的属性信息，中间用“:”隔开。第二行为read的碱基序列信息。第三行以“+”开头，一般与@后面的内容相同，可以省略，但“+”一定不能省。第四行代表read每个碱基的测序质量。

例如上例中HISEQ为测序平台名称，266为测序运行run的编号，HHNWKBCXX为流通池（flowcell）编号。



接下来四个数字为位置信息：



2、FastQC

对于新下机的原始数据，我们可以使用软件FastQC来对其测序质量进行质检。



质检报告包括有：



基因组/宏基因组鸟枪法测序数据reads比较随机均匀，碱基分布也会比较均匀，而扩增子数据由于两端都有引物，以及插入片段均为16S，所以会出现很多重复序列，且碱基分布非均匀。

PE表示paired-end数据的质量控制，SE也即single-end数据。

<hr/>03数据过滤



1、二代测序数据的指控步骤：raw reads→clean reads。



2、Trimmomatic工具的数据过滤步骤：



3、去除宿主序列

基于环境的复杂性与研究对象的不同，宏基因组数据在组装之前常需要过滤掉一些序列以防干扰研究。例如要研究动植物组织或肠道的微生物组，往往需要去除宿主的DNA序列。假如研究的是人类肠道微生物的宏基因组，需要去除属于人基因组的序列。具体方法为将质控后的序列和人类基因组序列进行比对，将比对上的序列去除。


参考文献：

［1］测序数据的解析：Fastq与FastQC-微生态与微进化
［2］《陈巍学基因》Hiseq测序仪工作原理

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/1895053851008157385