酶标仪可以做哪些检测？

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酶标仪可以做哪些检测？
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在现代生物医学研究和临床诊断中，酶标仪作为一种重要的检测设备，已成为实验室不可或缺的工具。它不仅以准确、有效的检测能力赢得了广泛的关注。那么，酶标仪究竟是什么仪器？它的原理、特点以及应用范围如何？本文将为您进行解析。


一、酶标仪的定义与基本原理
酶标仪是一种专为酶联免疫吸附实验设计的仪器，其核心基于固定波长滤光片的检测原理。通过提供波长范围从340nm至750nm的光学检测能力，仪器支持96孔酶标板操作，适用于不同的实验通量要求。
二、酶标仪的主要特点
1. 高寿命光源
光源采用6V 10W卤素灯，使用寿命可达到2000小时，确保实验中长时间稳定运行。
2. 快速读板功能
酶标仪具有快速的读板能力，单波长检测可在15秒内完成96孔板的检测，双波长检测则为28秒。
3. 振板功能
配备振板功能，用户可根据需要设置振板时间和速度，确保样品均匀混合，提高实验准确性。
4. 安卓操作系统
采用安卓操作系统，操作简便，并可通过多个USB接口连接外部设备，方便数据输出和管理。
5. 可视化布板
使用可视化布板方式输出测试结果，用户能够轻松查看每个孔位的实验数据，方便对结果进行实时监控。
6. 自动校准与自检功能
配备自动校准和光路自检功能，确保每次测量的准确性，及时检测和修正设备问题。
7. 多个滤光片组合
酶标仪配有8个滤光片轮，支持多种波长滤光片组合，满足不同实验需求。
三、酶标仪的应用领域
酶标仪因其高灵敏度、准确性和多功能性，在科研和临床两个领域得到了广泛应用：
四、选择酶标仪时的关键考虑因素
为了选择合适的酶标仪，用户需要关注以下几个方面：
检测范围和波长支持：根据实验需求，选择能够覆盖所需波长范围的仪器。
数据处理能力：有效的数据分析和输出功能能够提升实验效率。
性价比：综合考虑性能、售后等方面，选择合适的方案。
五、结语
酶标仪作为一种高度智能化的检测设备，酶标仪在科学研究与临床应用中发挥着重要的作用。从技术特点到实际应用，它的每一处设计都体现了对准确与效率的追求。未来，随着技术的不断进步，我们相信酶标仪将以更加多样化的功能和更高的检测精度，助力各领域的突破性发展。

大力水手

你相信“光”嘛！

光是电磁波，波长100nm-400nm称为紫外光，400nm-780nm之间的光可被人眼观察到，大于780nm称为红外光。人们只所以能够看到色彩，是因为光照射到物体上被物体反射回来。绿色植物之所以是绿色，是因为植物吸收了光中的红色光谱。酶标仪测定的原理是在特定波长下，检测被测物的吸光值。






“光”与酶标仪

酶标仪，即酶联免疫检测仪，用来检测ELISA反应后的吸光度值，主要由光路系统与信号采集系统组成。工作原理为：

光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，该单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上；






光电检测器将光信号转换成相应的电信号，经过一系列信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算，最后显示结果。酶标仪分类
按滤光方式分类
分为滤光片式酶标仪（固定波长酶标仪）、光栅式酶标仪（全波长酶标仪），这两种都是属于光吸收酶标仪；

滤光片是光学玻璃片镀制光学膜层，使滤光片对通过的波长发生变化，将不需要的波长光隔开。根据选配的滤光片，只能截取特定波长进行检测。






光栅型是使用物理性衍射光栅原理在不同角度将白光光源分开，再通过一系列狭缝将已选取的激发波长分出来。光栅型酶标仪可以截取光源波长范围内的任意波长，灵活度更高。






目前滤光片系统因价格较为便宜，检测灵敏度高，带宽的可选择性强，可以进行快速的滤光片切换等优点，其应用更广。

讨论--光栅和滤光片的区别比较
a、酶标仪光的纯度区别比较
光电检测以采用纯度高的光为佳，但不管采用哪种分光器，都不可能得到绝对纯的光。

光栅：就光栅分光后的一点而言，光是纯的，但由于透光孔具有一定宽度，比色皿所接受的光，是一个在指定波长附近波段上的等强的光。

滤光片：经滤光片分光后，通过透光孔被比色皿所接受的光也是一个波段，但在指定波长上光的强度最高，呈正态分布。

b、酶标仪光的稳定性区别比较
光栅：棱镜或者光栅片的绕轴旋转，由于不可避免的机械误差，并且小角度的偏差经过2-3次反射，会造成很大的偏差，造成波长的不稳定。另外光栅是窄缝，其能量也会很弱，小的检测电压信号为了获得大的电压值，必须以大倍数放大，这样误差也会被放大，会造成检测的不稳定

滤光片：由于从同一滤光片上每一点透过的光的波长都是相同的，每个位置是通过光偶准确定位，不受仪器本身机械误差的影响，所以，光强经会聚后，能量很高，电压信号也会相对强，主流光很强，其它杂光的影响就会很弱很弱，可以忽略到不计，误差也会很小，光是稳定的，检测相对很稳定。

c、酶标仪设备后期维护区别
光栅：一旦出现螺丝松动，传动误差，更换灯泡，造成中心波长偏移，那一般很难再调整回合适位置，必须由专业厂家来用专业设备调试完成，事实上国内大多数用户因为没有得到这方面的培训与告知，所以基本用了一年以后，发生了偏差也不会去找厂家去校准了。

滤光片：结构简单，便于维护。只要稍加培训即可完成维护。

d、酶标仪仪器检测灵敏度区别
滤光片具有非常好的透光率 (可高于85%)，也就是说光能量的损失比较少。在一个荧光检测中，经过滤光片进入样本的激发光和从样本透过滤光片进入检测器的发射光都只有少量的损失(大约10%)。光的损失较少，光的能量自然较大，荧光的信号自然很容易检测。这是获得高信噪比（SNR）的最初始保证。所以，由于有高的信噪比（SNR）保证，滤光片系统从酶标仪诞生以来一直就是高灵敏度检测的黄金标准。我们也不难发现很多有光栅型酶标仪的厂家在一些检测灵敏度要求比较高的高端应用(如：TRF、TR-FRET、等)中，都会有另外配上滤光片模块的设计。因为这些高端的应用，光栅系统未能有满意的效果或干脆做不到。

光栅系统带来方便，但也有一些缺点。基于光路设计的问题，光栅的光能损失比滤片大很多。在荧光检测中，光源经过光栅而成的激发光已比原来的少了能量。样本被激发后会放出发射光，发射光会透过光栅去分隔出需要的波长。被分隔后的发射光能量再损失。光栅酶标仪的灵敏度没有滤光片酶标仪好的，所以在高端光栅型的酶标仪也要配备滤光片模块才能进行TRF、TR-FRET等高灵敏度需求的检测。

按功能分类
可分为单功能酶标仪（分为光吸收、荧光、化学发光等）和多功能酶标仪。多功能酶标仪是以上两种或更多检测模块的集成，通常情况下至少可提供光吸收、荧光这两种最常见检测功能，而一些中高端多功能酶标仪还可支持化学发光、时间分辨荧光、荧光偏振、生物发光共振能量转移，甚至还可以支持“Western Blot”和“上转换发光”等检测。用什么“光”来检测量
测量波长的原理

光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。

检测单位用OD值表示，OD是opticaldelnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，OD=10g（1/trans），其中trans为检测物的透光值。根据Bouger-amberT-beer法则，OD值与光强度成下述关系：

E=OD=logⅠ0/Ⅰ其中E表示被吸收的光密度，Ⅰ0为在检测物之前的光强度，Ⅰ为从被检测物出来的光强度。

OD值由下述公式计算：

E=OD=C×D×E

其中：C为检测物的浓度；D为检测物的厚度；E为摩尔因子。

在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造成检测结果的不准确。因此，在测定检测物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波长。

但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸收，我们再选取一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长下，检测物光的吸收最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。






常用波长
一般酶标仪的测定波长在400～750nm或800nm之间，完全可以满足ELISA的显色测定。

目前国内常见的ELISA试剂盒所使用的标记用酶均为辣根过氧化物酶(HRP)，底物通常为四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD)，其在过氧化氢溶液的存在下，经HRP作用，分别氧化为二氨基偶氮苯(DAB)和联苯醌。

当pH值为5.0左右时，DAB在450nm波长处有最大吸收；

当pH值降为4.0时，最大吸收波长移至492 nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。

TMB的氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，H：O：和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。

降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min。

450nm和492nm两个波长是目前ELISA测定最常用的，考虑到双波长比色的需要，还应有630nm和405nm波长的滤光片。

单波长/多波长检测
酶标仪有单波长和双波长检测功能有时使用者不知在什么情况下使用单或双波长检测。

所谓的“单波长”就是使用一种对显色具最大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定；

而“双波长”则除了用对显色具最大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630nm进行测定，酶标仪最后打印出来的吸光度则为二者之差。

630nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自于板孔上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。因此，在ELISA比色测定中，最好使用双波长，且不必设空白孔。吸光度测定范围
通常，酶标仪的吸光度测定范围在0～2.5之间即可以满足ELISA的测定要求。早期的酶标仪可测定的吸光度一般在0～2.5之间，但现在基本上都做了拓宽，可达到3.5以上，并且能保持很好的精密度与线性。因此，对于酶标仪的吸光度范围不必去刻意追求大的吸光度范围，主要看在一定的吸光度范围内的线性和精密度如何检测速度
酶标仪的检测速度是指其完成比色测定所需要的时间。所谓天下武功唯快不破，检测速度快，有利于提高检测的精密度，即避免由于测定过程中，因测定时间不同所致的各微孔间吸光度间的差异。目前市场上常见的酶标仪检测速度都非常快，通常在数秒钟内。振板功能
酶标仪的震板功能是指酶标仪在对ELISA板孔进行比色测定前对其进行振荡混匀，使板孔内颜色均一。目前市场上常见的酶标仪均有震板功能，有所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋转等方式及振荡幅度等任意调节。使用有震板功能的酶标仪，在进行ELISA测定，显色反应完成加入终止液后，可不必振荡混匀，直接放入酶标仪测定即可。温育功能
温育功能是指酶标仪本身能按要求自动精确地控制仪器内部的温度，使得ELISA测定中微孔板条的温育过程可在仪器内部完成，而无需再外配温箱。

温育功能只是酶标仪的一个附加功能，是否具有并不能说明酶标仪档次的高低及仪器的优劣。作为实验室是否选择，则可根据自己实验室的条件及需要来决定。软件功能
软件功能是指酶标仪所具有的对ELISA定性和定量测定及其他测定方式如酶标动力学、紫外和凝集等数据的统计分析并报告结果的功能。软件功能是中高档酶标仪的一个非常重要的功能。

软件在读数前可设置读数孔、波长、计算公式等内容，在读数后显示相关数据。对于用户来说，好的软件功能，对实际工作会有较大的帮助。ELISA定性测定，酶标仪如具有阳性判断值(cut-off)及其测定“灰区”(即指测定吸光度处于cut—off周围的一定区域，此区域内结果应为“可疑”)的统计计算功能，不但方便了实验室工作人员，而且在某些特定的情况下，有很高的实用价值。检测项目
▶临床检验项目
★感染免疫室检测：乙肝五项(HBV)、甲肝抗体(HAV)、戊肝抗体(HEV)、丙肝抗体(HCV)、免疫球蛋白(IgG)、艾滋病抗体(HIV)、梅毒螺旋体抗体......

★血液免疫学检测：免疫球蛋白A/G/M/E/D、免疫球蛋白轻链κ/λ、补体C3/C4、CRP、类风湿因子、前白蛋白、铜蓝蛋白、触珠蛋白、β2微球蛋白、转铁蛋白、酸性糖蛋白、超敏CRP、血清淀粉样物质A、γ痕迹蛋白、循环免疫复合物、ANA、ENA......

★过敏原检测：血清总IgE、特异性IgE及过筛试验、ECP检查......

★肿瘤标志物的检测：癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、前列腺特异性抗原（PSA）、糖类抗原（CA199）、糖类抗原（CA125）、 糖类抗原（CA153）、鳞状细胞癌抗原（SCC）......

★生殖医学检测：弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型和II型、抗精子抗体、抗子宫内膜抗体、抗卵巢抗体、抗滋养膜细胞抗体、抗hCG抗体......

▶食品安全检测项目
★过敏原：食品 ；

★三聚氰胺：农产品和食品 ；

★二噁英：农产品和食品、环境样品 ；

★兽药残留

★抗生素：农产品和食品 ；

★克伦特罗/瘦肉精：禽畜的尿、毛、肉、奶、饲料等 ；

★农药残留：农产品、食品、水、土壤等

★杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物/昆虫生长调节剂 ；

★生物毒素：食品和饲料

★黄曲霉素；贝类毒素；呕吐毒素；黄曲霉毒素B1；玉米赤霉烯酮；赭曲霉毒素A。

▶出入境检验检疫项目
出入境检验检疫项目

★卫生检疫：出入境人员丙肝、HIV、梅毒抗体检测 ；

★动物CIQ：猪传染性胃肠炎病毒（生物素标记414 nm），猪呼吸道冠状病毒（生物素标记414 nm），猪流行性腹泻，鸡传染性法氏囊病（490 nm），鸡传染性喉气管炎，牛传染性鼻气管炎（450 nm）等出入境动物病毒检测；

★植物CIQ：番茄黑环病毒检测、豇豆重花叶病毒（碱性磷酸酶标记405 nm）。

▶细胞增殖与细胞毒性检测
通过测定570nm 波长处的吸光值，可间接反映活细胞的数量。细胞增殖越多越快，则吸光值越高；细胞毒性越大，则吸光值越低。

★CCK-8：
测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

▶蛋白浓度测定（比色法）
★BCA法：562 nm；

★考马斯亮蓝法：595 nm；

★660nm蛋白分析定量试剂：660nm。

▶内毒素检测

★动态显色法（微量技术）：405nm。

▶酶活测定
原理：酶活性的检测基于底物NADH的消耗或产生，可以通过检测NADH而间接定量酶活性。

检测方法：37℃保温下，在340nm处使用动力学检测方法测定酶活性。

★具体应用：谷丙转氨酶（ALT）的检测（肝功能） 、尿素氮的检测（脲酶-NADH法）（肾功能）、葡萄糖6磷酸脱氢酶的检测（溶血病）、已糖激酶（血清葡萄糖）。

大力水手

酶标仪即酶联免疫检测仪，酶标仪检测技术是一种高通量微孔板检测技术，操作简便，被广泛应用于生命科学、生物制药、体外诊断、食品安全、环境科学等领域。传统酶标仪是指具备吸收光检测功能的酶联免疫检测仪，随着科学技术发展和市场需求不断丰富，如今酶标仪所具备的检测功能日益丰富，在光吸收检测(Abs)基础上增加了荧光强度(FI)、发光检测(Lum)、荧光偏振(FP)、时间分辨荧光(TRF)、匀相时间分辨荧光(HTRF)等多种检测技术。然而每一种技术都具有独特的应用价值和局限性，下面将对几个主流技术进行详细介绍。
吸收光检测

工作原理与主要结构和光电比色计基本相同，在特定波长下检测被测物的吸光值，称为光吸收检测（Absorbance，Abs）。只做吸收光检测的酶标分析仪实际上就是一台变相光电比色计或分光光度计，其基本工作原理与主要结构和光电比色计基本相同。光源发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，进入塑料微孔板中的待测标本。
该单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上，光电检测器将这一待测标本不同而强弱不同的光信号转换成相应的电信号，电信号经前置放大，对数放大，模数转换等信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算，最后由显示器和打印机显示结果。特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系，即符合朗伯比尔定律。



光吸收酶标仪的技术原理示意图



朗伯比尔定律

典型应用：核酸和蛋白质定量、ELISA、酶学检测、细菌生长OD600测定、内毒素检测、MMT/CCK8等细胞活力分析。
荧光强度

荧光(Fluorescence)是一些原子和分子吸收特定波长的光（激发：Ex），随后短暂发射 (Em) 更长波长的光的特性。激发峰和发射峰之间的距离称为斯托克斯 (Stokes) 位移，该位移取决于荧光基团。荧光利用一个外部光源，在特定波长下激发样品，荧光基团受到适当波长的激发，分子从基态转化成激发态。随着分子回到基态，能量会以热（损失能量）和能量更低、波长更长的光的形式释放。
具备荧光强度 (FI) 检测模式的微孔板读板机使用一种光源（通常是氙闪灯或 LED），来激发特定波长的荧光基团（荧光分子）。可以使用一个特定波长的滤光片或可连续调节波长的单色器，来选择激发样品所需的波长。
荧光基团随后会释放出一个不同波长的发射光，经由另一个滤光片或单色器进入检测器 PMT。光电倍增管 (PMT) 可以检测这种发射的荧光值，样品的荧光强度用相对荧光强度单位（RFU）表示。



荧光检测示意图

荧光强度即发射荧光的光量子数，荧光强度与溶液吸收光强度，荧光量子效率以及周围环境等因素有关。荧光的颜色多为红色、绿色、蓝色等。
典型应用：核酸等生物大分子定量、酶活性分析、荧光免疫分析、细胞学分析(细胞增殖、细胞毒理、细胞吸附等)、胞内钙离子浓度的变化、荧光蛋白的报告基因分析 (GFP)、细胞凋亡等。
发光检测

发光检测(Luminescence, Lum)包括化学发光(Chemiluminescence)和生物发光(Bioluminescence)，是样本孔内发生的化学、生化或者酶反应发出的光信号。与光吸收和荧光检测不同的是，发光检测不需要激发光源，这就使得发光更敏感，更不容易引起背景噪音。
化学发光是由化学反应引起的一种特殊的发光现象，即通过氧化还原反应释放的能量将体系中某一物质从基态跃迁至激发态，随后以辐射发光(紫外光、可见光或近红外光)的形式返回基态释放能量。其过程由化学激发过程和发光过程两部分组成。根据能量作用过程，发光可以是一种“闪光”或“辉光”反应，这取决于其动力学特征。闪光型发光会在短时间（通常是几秒）内发出非常明亮的信号。辉光型发光发射的信号更加稳定，但通常较弱，可持续几分钟甚至几小时。
生物发光是生物体内的发光蛋白通过消耗能量物质而产生的发光现象，其特点是只消耗能量物质,不消耗发光物质。生物发光属于冷光范畴,即发光不是由于发光体温度升高所致,发射波长也与其温度无关。目前被发现的生物发光底物有虫荧光素、腔肠素、虾素等。
与光吸收和荧光相比，发光是一个适合许多应用的极其普遍的检测方法。它通常有较宽的动态范围和较高的灵敏度（比荧光高2-3个数量级），因为背景干扰（化合物、培养基和细胞的自发荧光）较低。此外，发光测定常常是均相的（无清洗步骤），因此在高通量应用中能更简单地进行自动化操作。



发光检测示意图

典型应用：单/双荧光素酶报告基因、BRET、细胞活力检测、细胞增殖检测、支原体检测、细胞毒性检测、ATP、dsDNA、水母发光蛋白Ca2+、基于化学发光的ELISA检测等。
荧光偏振

当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期保持静止，发射光将位于同样的偏振平面。如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面。这一现象称为荧光去偏振（Fluorescence Polarization ，FP）。FP用于检测溶液中生物大分子与小分子之间的相互作用。大、小分子未结合时，荧光标记的小分子运动速度快，发射光去偏振化，检测到低的毫偏振值(mP)；而当荧光标记的小分子与生物大分子结合后，旋转变慢，发射光保持偏振性，检测到高的毫偏振值(mP)，mP值的高低与分子相互结合的效率成正比。



荧光偏振信号测量原理

典型应用：受体/配体研究(如激素/受体检测)，蛋白质/多肽相互作用，DNA/蛋白质相互作用，酪氨酸激酶检测，竞争性免疫检测、单核苷酸多态性筛选、实时定量PCR-FP、体外细胞损失检测等。
荧光共振能量转移

1948年，Foster首次提出荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)理论，指两个荧光基团间能量通过偶极-偶极耦合作用以非辐射方式从供体(Donor)传递给受体(acceptor)的现象。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7~10 nm时即可发生FRET。随着距离延长,FRET 呈显著减弱。
想要实现FRET，荧光供体和受体分子必须满足以下几个前提条件：
(1)供体分子的发射光谱和受体分子的吸收光谱须有一定程度的重叠，一般大于30%(重叠越多，FRET效果越好);
(2)供体分子和受体分子间的距离须小于10nm(一般为7～10nm);
(3)供体分子和受体分子的共振方向须平行或近似平行；
FRET主流的荧光探针主要有三种：荧光蛋白、传统有机分子和镧系元素。



FRET信号测量原理

典型应用：蛋白结构和构象改变、蛋白的空间分布和组装、受体/配体相互作用、核酸结构和构象改变、脂类的分布和转运、膜蛋白的研究、核酸检测等应用。
生物发光共振能量转移

生物发光能量共振转移(Bioluminescence Resonance Energy Transfer, BRET)检测原理与FRET类似，不同的是供体产生生物发光来激发受体荧光分子，无需激发光，背景更低，也避免了光漂白和自发荧光等问题。



BRET原理示意图

BRET与FRET相比，供体采用萤光素酶生物发光，不再需要激发光，因为没有样品自发光干扰，所以背景更低，信噪比更高。
典型应用：活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用。
时间分辨荧光

时间分辨荧光(Time-resolved fluorescence, TRF)是一种高级荧光检测技术，使用镧系金属做荧光标记(其荧光比普通荧光持续时间更长，普通荧光的半衰期为纳秒级，镧系元素的半衰期是毫秒级)，利用荧光分子之间荧光寿命的差异来分离所需的荧光信号。
与传统荧光检测方法相比，TRF具有灵敏度高、样品制备简单、检测重复性好的优点。最常使用的镧系元素是铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)和镝(Dy)为标记物，来代替常用的荧光物质对抗原抗体进行标记，这些镧系元素通常以螯合物的形式应用以获得优质的信号强度和稳定性,并使用带有时间分辨荧光检测功能的仪器(如酶标仪)来对荧光强度信号进行检测，最终绘制标准荧光曲线，定量分析待测物的浓度。



TRF原理示意图

典型应用：GPCR测定、激酶测定、细胞因子和生物标志物检测、细胞代谢、蛋白质-蛋白质相互作用、受体-配体相互作用、药物发现、高通量筛选等。
均相时间分辨荧光

均相时间分辨荧光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF)是基于TRF技术衍生出的新技术，将TRF技术和FRET技术相结合，能量供体选择镧系元素铕(Eu)和铽(Tb)的穴状化合物，交联别藻蓝蛋白(cross-linked APC)或小分子荧光探针d2作为受体，当供体和受体距离足够近时，供体被一个能量源激发，可以引发能量转移到受体，使其在特定波长发出荧光，用于检测生物分子之间的相互作用。



HTRF原理示意图

检测时，通过延缓检测时间，让短寿命的荧光衰变掉后，再检测荧光强度，消除背景荧光的干扰。同时HTRF技术在均相溶液中一步反应，无需包被、封闭、洗涤等繁琐的操作步骤。因此该技术具有背景低、特异性好、操作简单、体系稳定等优点。
典型应用：GPCRs配体结合、细胞水平的蛋白激酶实验、蛋白磷酸化、生物治疗药物研发、蛋白互作、生物因子或者趋化因子等。

队长是我

工欲善其事必先利其器，生物制药从前期药物靶点确认，高通量筛选，药物优化，活性功能分析，工艺开发，直至质量控制都离不开酶标仪这一检测工具。一款优秀的酶标仪，在灵敏度，稳定性，功能多样性几个维度如何平衡和把握呢？
酶标仪最常规的功能包含光吸收，荧光和化学发光，这三种应用能够满足比较基础的检测需求。但它们在原理上有着迥异的差别：光吸收是基于光通过物质时被吸收的定律进行定性和定量分析；荧光是荧光分子中处于激发态的原子核外电子由高能级回到低能级所产生的辐射；化学发光的检测信号是酶促反应过程中释放的光子，不需要激发光。因此，若想获取比较好的检测结果，三种功能模块的检测器需要独立才是，尤其是化学发光，需要独立于荧光之外的超敏感检测模式，放大检测光子信号、减少空间串扰，才能在实验中得到更好的检测窗口。



质的飞跃——EnSight超敏化学发光
EnSight这款多模式检测仪最初的设计理念就是模块化的光路设计，不同且独立的检测器满足不同应用需求。采用专用超敏感化学发光检测器以及免光纤的光路，在检测时更靠近检测样品，有效避免相邻样本的交叉干扰，也更易于捕捉微弱信号，有效区分背景干扰和样品信号，相对普通化学发光，灵敏度提升10倍，孔间串扰低0.05%，确保实验结果的可靠和准确。



EnSight超敏化学发光检测光路以及与一般化学发光的比较

2020年，中国食品药品检定研究院（简称中检院）王佑春团队在EmergingMicrobes &Infections上发表了重要论文，本文作者开发了SARS-CoV-2抗病毒检测的PBNA(pseudovirus-based neutralization assays)评价方法。首先作者构建并滴定SARS-CoV-2假病毒；接着对SARS-CoV-2 PBNA体系进行了优化；最终将此PBNA体系可作为疫苗对抑制SARS-CoV-2侵入效果和靶向病毒入侵治疗方案的评价方法。
作者全程借助EnSight和Britelite底物进行化学发光检测：

• SARS-CoV-2假病毒构建和滴度检测
  
• SARS-CoV-2中和反应检测方法的建立和验证
  

基于整个检测系统的高灵敏度和稳定性，该方法作为标准SOP下发各省疾控，同时提供给新冠疫苗和治疗药物开发机构，以评估候选疫苗或药物的疗效。



SARS-CoV-2 PBNA验证和工作流程

除了基础的三功能，要实现更多的检测应用，尤其是药物研发阶段，具有多功能或可扩展性的酶标仪是更好的选择。
EnSight除具有基本功能高精度四光栅（光吸收、荧光）模块和超灵敏独立化学发光检测以外，还可扩展超灵敏度Alpha检测功能以及高灵敏时间分辨荧光&高兼容性TR-FRET。

Alpha,让最费时耗力的ELISA得以解放
说起ELISA，可谓是免疫学中的经典实验，但是做过的小伙伴都知道，过程“耗时耗力”，加样，甩板子，洗涤，反复循环，一次实验耗费大半天时间。那么，到底怎样才能实现灵敏度又高，流程又短，省时省力的目标蛋白检测呢？
只需混合无需洗涤的ELISA——Alpha提供解决方案。和ELISA相比，Alpha是为均相检测，操作十分简便。可省去费时费力的清洗步骤，无论是总的实验操作时间，还是试剂准备时间都被大大缩短。


Alpha检测须配置高强度的激光光源，以激发出供体微珠上足量的单体氧分子。EnSight超灵敏HTS Alpha模块在配置激光光源和超灵敏PMT的基础上，又对光源和PMT进行了优化，因此其信噪比更高、检测速度更快，得到低背景、高灵敏度的信号。再者，易于实现自动化分液操作，非常适合高通量筛选。


技多不压身——时间分辨荧光(TRF)
稀土元素在受到荧光激发时，发生荧光衰减的周期通常是很长，能达到1-2ms，可以满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。TRF光信号比普通荧光信号较弱，EnSight采用优化的滤光片及专用二向色镜光路，以尽量保证激发光强度、光透过率及杂信号干扰，以达到更好的检测灵敏度和信噪比。

EnSight还是一台细胞成像分析仪
酶标仪一般是通过读取光强度值这一单一维度来评估样品信息，但细胞类检测对数据的更高要求，如细胞数量、生长融合度、细胞形态和增殖、凋亡水平、病毒空斑实验等。EnSight十八般武艺，样样精通。
EnSight具有高速高效细胞成像模块，采用先进的sCMOS相机以降低信号背景噪音，激光自动聚焦以快速成像，固态光源(LED)以进行短时照明。可以依次进行多通道检测，一整个384孔板整板生成单色图像只需大约5分钟。相比人工计数和分析，可以显著提高实验通量以及实验结果的准确性和稳定性。



EnSight 多模式检测仪进行成像和空斑计数分析



人工计数和EnSight计数的比较

如虎添翼——智能分析软件
出色的酶标检测结果，离不开硬件全程保驾护航，同时更需要一个好的军师——分析软件。
EnSight基于工作流程的Kaleido数据采集和分析软件方便易学，其用户界面会引导实验进行，更加轻松自如地设置和运行多技术流程。用户可根据自己的技能水平和熟练程度设置实验方案。预制的方案有助于更快启动实验，非常适合新手和日常应用。利用该软件的任务工具箱，可以将任务结合起来创建自定义方案，因此可以在更广泛的成像应用中快速获取结果。
集美貌与才华与一身，EnSight多功能酶标仪以一种独特的方式将标记技术与微孔板显微成像技术完美整合，为您的研究提供一种真正的正交方法，使您获得前所未有的深入见解。

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继续前进

目前酶标仪上有7大主流的常用检测技术，分别是光吸收、荧光强度、化学发光、时间分辨荧光、荧光偏振、多标记检测和Alpha（Molecular Devices研发生产的酶标仪涵盖所有技术）。这些常用检测技术其实涵盖了非常广阔的应用方向，总结起来就是四大类，分别是分子生物学、药代动力学、细胞信号转导通路和微生物学。
具体到每一类研究方向上，分子生物学方向可以用酶标仪来做例如核酸/蛋白的定量和报告基因的检测，药代动力学方向可以用酶标仪来做细胞增殖，细胞毒性和细胞凋亡的研究。细胞信号转导通路方面，可以用于检测激酶、NFkB、cAMP、Ca2+等等，而微生物学方向通常使用酶标仪来做比如细菌增殖、内毒素、支原体等等的检测。