重新定义分子诊断：快速、稳定的qPCR、LAMP和NGS解决方案

营养师

分子诊断技术已广泛应用于解决临床问题，但在全面普及方面仍面临挑战，包括对用户更快速触达率、检测的高效快速研发并商业化能力、更简单的储运系统等。
使用含有适当赋形剂的无甘油分子诊断原料可与冻干工艺兼容，从而实现室温稳定的检测。
针对特定应用的预优化配方能够加速检测方法的开发。
检测原料试剂的配方能对不同样本类型（如血液、尿液）中的抑制作用具有高效耐受性能，在不需要进行核酸提取的情况下，快速准确地获得检测结果。
本文通过评估针对血液和尿液样本的冻干优化PCR和LAMP试剂，展示这些创新的原料试剂在简化检测流程的独特能力，通过消除核酸提取步骤，从而加速诊断检测的开发。
类似的，通过使用全新的冻干NGS建库酶，进行NGS文库制备，验证了NGS试剂可以实现常温储存的同时，仍能保持其优异的性能。



研究1：qPCR检测
尿液样本：本研究使用的尿液样本来自于5位随机性别的个人、提供的未经过滤的尿液样本的混合样本。
检测过程：使用Meridian的尿液专用Lyo-Ready可冻干尿液直扩RT-qPCR预混液（MDX153），与引物和探针一起冻干。检测是直接使用尿液样本对冻干的预混液复融，进行直接RT-qPCR检测，反应条件为50°C，10分钟；95°C，2分钟；95°C，10秒+65°C，30秒， 45个循环。在相同反应中，采用了竞品试剂作为对比参照（使用供应商推荐的浓度进行测试）。
检测结果：



分别使用冻干的Lyo-Ready 可冻干尿液直扩RT-qPCR预混液（红色）和BioRad Reliance One-Step Multiplex Supermix（粉色）对10%人体尿液样本（来自膀胱癌患者）中三种肿瘤mRNA标记物（CDC2激酶，IGFBP5和MDK）进行多重扩增。结果显示，Lyo-Ready可冻干尿液直扩RT-qPCR预混液能比对比试剂更快速、更灵敏地从尿液样本中检测到癌症相关的RNA标志物。

研究2：LAMP检测
血液样本：K2-EDTA人类全血 和人类血浆。
检测过程： 使用Meridian的血液专用Lyo-Ready可冻干血液直扩RT-LAMP预混液（MDX125）与引物一起混合后冻干。直接使用血液或血浆样本复融冻干物，进行直接检测。LAMP反应为65°C，60分钟。在相同反应中，使用了两种竞品试剂进行对比。所有反应都使用SYTO™82荧光染料对扩增产物进行检测。
检测结果：



将Lyo-Ready可冻干血液直扩RT-LAMP预混液 (MDX125, 红色)与靶标登革热病毒1型、HCV、WNV、寨卡病毒或 HIV-1引物同时冻干。冻干反应混合物与NEB WarmStart®LAMP kit (橙色) 和Thermo SuperScript IV RT-LAMP Master Mix (黑色) 进行平行对比，用来对 5-20% K2-EDTA 全血或血浆样本直接扩增。误差条表示四个技术重复的标准偏差。结果显示，迈迪安的Lyo-Ready可冻干血液直扩LAMP/RT-LAMP预混液对不同的病原体DNA和病毒RNA靶标的扩增比对比试剂反应速度更快 (TTR更短)，在有抑制物存在的情况下有更强的耐受性能、反应更快速、扩增更好。

研究3：NGS
NGS文库制备：使用Covaris LE220超声波破碎仪将100 ng纯化的基因组DNA切割为300bp，使用Meridian 冻干NGS文库制备试剂盒（MDX219）进行末端修复、加A尾、连接Illumina适配子，并进行PCR扩增（4个循环）。在每个必需步骤中，使用Beckman Coulter的AMPure XP磁珠清理处理过的片段。文库通过Meridian qPCR文库定量试剂盒（MDX039）进行定量，其片段大小分布通过Bioanalyzer评估。
NGS测序：文库稀释至12 pM，加载到MiSeq Reagent Kit v2（500循环）试剂盒的芯片中。测序以2 × 250 bp的配置进行。读取数据通过BWA-MEM2映射到E. coli K12 MG1655参考基因组，并使用bcftools进行分析。数据分析内容包括碱基识别、样本条带分离、读取数量、映射效率、GC偏差、重复率及序列碱基成分。最后，对液态和冻干形式NGS建库试剂盒生成的文库数据进行了对比分析。
检测结果：



分别使用冻干NGS文库建库试剂盒（MDX219，红色）及其液体形式（蓝色）对大肠杆菌全基因组建库，结果表明，两种形式建库试剂盒建成的文库在质量和产量上具有可比性。通过Bioanalyzer 曲线和qPCR定量扩增确认，两种试剂形式均表现出一致的信号特征和产量。





将以上建库文库进行测序，结果显示，液体和冻干试剂建立的文库在读取数、比对率、GC偏向性、文库多样性以及重复率等方面表现相似。具体而言，修剪前的读取数表明比对效率良好。两个文库表现出均一的GC含量、相近的重复率和预期的序列碱基组成。总体而言，冻干形式的NGS建库试剂制备的文库在性能数据与与液体建库试剂制备的文库性能表现一致，同时具备简化物流和存储的潜力。

总结
本研究旨在展示先进的分子诊断原料如何支持更多的检测研发人员实现更快的商业化和更可持续的分子诊断检测产品。

• 预优化的qPCR/LAMP扩增化学体系加速了新型MDx检测方法的开发时间。这些专用原料试剂不仅能显著缩短检测开发的优化步骤，还因其稳健性和可靠性更有助于完成通过检测验证环节。
  
• 冻干及兼容冻干的试剂在试剂检测性能上具有和液体相同的性能。本研究证明了，在多个技术平台（如qPCR、LAMP或NGS）中，试剂在常温下储存时仍能保持市场领先水平的性能。通过加速新检测方法的开发并实现常温储运的操作，所展示的技术无疑将推动MDx在全球范围，特别是在发达国家之外的普及。
  

CACLP 相聚共讨

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迈迪安开发分子检测原料

NGS建库全面解决方案
产品编号	产品名称	作用
MDX219	冻干NGS建库试剂盒	NGS建库
MDX207	无甘油T4 DNA聚合酶10U/μL	末端修复
MDX208	无甘油T4 DNA聚合酶IKlenow大片段，50U/μL	末端修复
MDX206	无甘油T4多核苷酸激酶20U/μL	磷酸化
MDX011	无甘油Taq DNA聚合酶50U/μL	A尾
MDX200	无甘油T4 DNA连接酶50U/μL	链接适配子
MDX203	无甘油高保真Pfu聚合酶20U/μL	文库富集
MDX041	NGS建库磁珠	清洗&选择大小
MDX039	NGS文库定量试剂盒	文库定量

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