分子互作|蛋白与蛋白、核酸、小分子互作检测技术介绍、应用全面解析

Rose

生物分子相互作用的研究对于深入了解生物系统至关重要，也是了解生物过程的基础。蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-小分子的互作研究支持着细胞功能研究和疾病治疗发展。在实际的研究过程中，由于实验的样品和目的不同，会用到的实验技术也不尽相同。本文将从这些技术的原理，实验步骤，技术特点，应用等方面为大家做归纳和介绍。

生物分子互作技术总结



一、蛋白和蛋白相互作用
01 Co-IP
❖原理
免疫共沉淀(CoIP)技术基于抗体和蛋白的特异性亲和作用，通过ProteinA、G琼脂糖珠或者磁珠偶联目标蛋白的特异性抗体，进而从复杂的样品（如细胞裂解液）中捕获及富集目标蛋白，同时可以测定与目标蛋白相互作用的蛋白或其它生物大分子。


❖技术特点
Co-IP是经典的检测蛋白互作的技术，实验步骤相对简单，不需要用到特殊的仪器设备。由于在细胞内完成，更能反映蛋白质在天然状态下真实的相互作用。由于沉淀下来的是蛋白复合物，不能证明两个蛋白间有直接的相互作用，可结合GST pull down实验进行检测。

❖实验步骤
1、样品制备：细胞裂解释放蛋白；
2、免疫沉淀：ProteinA/G琼脂糖珠或者磁珠先和目标蛋白抗体进行孵育，然后加入细胞裂解液；
3、洗杂和洗脱：加入洗涤液进行清洗，去除未结合的杂蛋白。洗脱目标蛋白复合物；
4、结果分析：后续可用WB实验或者质谱实验分析；

❖应用
1、确定两种蛋白在体内是否结合，一般在后面接WB实验；
2、确定两个蛋白的结合的结构域或者位点，一般结合片段截短或者突变实验；
3、筛选和目标蛋白相互作用的未知蛋白，一般结合质谱实验；

02 GST pull down
❖原理
GST pull down技术基于GST标签和谷胱甘肽（GSH）的特异性高亲和力，将带有GST标签的目标蛋白固定于GSH琼脂糖珠上，当细胞裂解液经过该基质时，与目标蛋白有相互作用的蛋白或者大分子会被吸附，而没有被吸附的杂质则随缓冲液流出。


❖技术特点
实验步骤相对简单，不需要用到特殊的仪器设备。实验条件温和。可以证明两个蛋白有直接的相互作用。该实验是体外实验，可能无法完全反映体内条件下的蛋白互作情况，可结合Co-IP技术进行检测。

❖实验步骤
1、GST标签蛋白表达和纯化；
2、GST标签蛋白偶联GSH琼脂糖珠或者磁珠；
3、和细胞裂解液或者另一个蛋白共同孵育；
4、清洗和洗脱：清洗掉非结合蛋白，洗脱目标蛋白；
5、蛋白检测和分析：可以用WB或者质谱进行检测；

❖应用
1、确定两种蛋白是否有相互作用，一般在后面接WB实验；
2、确定两个蛋白的结合的结构域或者位点，一般结合片段截短或者突变实验；

03 Biacore
❖原理
Biacore技术是一种基于表面等离子共振（SPR）原理检测生物分子相互作用的技术，可以用来检测蛋白和蛋白，蛋白和核酸，蛋白和小分子，抗原和抗体等之间的相互作用。通常将两种相互作用的物质中的一种作为配体偶联在芯片上，另外一种作为分析物流经芯片表面，当分析物和配体结合时，会引起芯片表面SPR角的变化。通过仪器监测SPR角度的变化，可以实时监测生物分子的动态结合和解离过程。


❖ 技术特点
1、无标记检测：无需对样品进行标记，避免了标签、生物素或者同位素的干扰；
2、实时检测：可以实时观察到分子间结合和解离的过程；
3、高分辨率，高灵敏度：能够检测出非常弱的相互作用；
4、不仅可以检测有没有相互作用，还可以检测相互作用的亲和力，动力学和浓度等信息；
5、需要Biacore仪器进行实验；

❖实验步骤
1、配基偶联：将两个蛋白中的一个作为配体偶联在芯片上；

2、样品进样：另一个蛋白作为分析物从芯片上流过；如果两个蛋白有相互作用，仪器会进行记录；
3、芯片再生：使用再生缓冲液去除全部的分析物；
4、数据分析：使用仪器自带的软件进行数据分析；

❖应用
1、确定两个生物分子之间是否有相互作用，以及相互作用的亲和力，动力学和浓度等信息；
2、抗体药物开发中进行药物的筛选、抗体和靶点的相互作用；
3、小分子药物垂钓；

04TR-FRET
❖原理
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）是基于荧光共振能量转移（FRET）和时间分辨荧光（TRF）两大技术原理的高通量药物筛选技术。在待检测的两个分子上分别标记供体和受体荧光基团，当待测分子互相靠近时，供体基团激发能量可以转移到受体基团，使受体基团发出特定波长的荧光。利用镧系元素荧光半衰期长的特点，可以通过时间延迟显著降低背景信号，提高检测的特异性和灵敏度。


❖技术特点
1、均相检测：无需洗板和包被，省时省力；
2、操作简单：空板加样即可检测，2H完成检测；
3、节省样品：总体系20ul；
4、通量高：可用96，384孔板等；
5、通过酶标仪检测；

❖实验步骤
1、实验准备：选择合适的TR-FRET试剂盒，并根据实验目的准备样品和试剂。样品可以是细胞培养上清、组织匀浆或纯化的蛋白溶液。
2、加样：将实验所需的Donor和Acceptor标记的试剂以及待测样品加入到孔板中。
3、孵育：将加样后的孔板在指定的温度下孵育一定时间，孵育时间通常为2小时。
4、检测和数据分析：孵育完成后，使用多功能酶标仪或者时间分辨荧光检测仪进行检测，并进行数据分析。

❖应用
1、药物靶标高通量筛选；
2、发现和验证疾病相关生物标志物；

05 PLA
❖原理
邻近连接技术（PLA）基于一对带有DNA寡核苷酸标签的特异性抗体（PLA探针），这些抗体能够识别并结合目标蛋白。如果待检测的两个蛋白有相互作用，则两个探针就会互相靠近，携带的DNA序列会进行连接和滚环扩增而产生一个长的DNA产物，这个产物可以被检测。


❖技术特点
1、双抗体检测特异性高；
2、等温PCR扩增放大信号；
3、原位可视化：内源水平可视化研究蛋白的互作、定位和定量；

❖实验步骤
1、封闭样本
2、一抗孵育：两种一抗分别与位于一种蛋白质或两种邻近蛋白质上的目标表位结合；
3、Navenibody孵育：Navenibodies（与专有寡核苷酸臂结合的精选抗体）与各自的一抗结合；
4、DNA circle形成：当 Navenibodies 靠近时，附着的寡聚物能形成 DNA circle，通过减少非特异性背景染色来保证高特异性；
5、扩增和检测：加入聚合酶后，就会启动滚环循环扩增过程。标记的探针与扩增的DNA结合，显色形成亮点；

❖应用
1、信号转导通路研究；
2、疾病机制研究；

06 BLI
❖原理
生物膜干涉技术（BLI）是一种基于光干涉原理的非标记技术。它通过检测传感器表面分子结合引起的干涉光谱位移变化来监测分子间的相互作用。当分子结合到传感器表面时，会引起传感器末端生物膜的厚度变化，进而导致干涉光谱的位移。这种位移可以通过光谱仪实时监测，从而得到结合曲线。


❖技术特点
1、无标记检测；
2、实时检测；
3、高灵敏度；
4、需要BLI仪器进行实验；

❖应用
1、抗体药物开发
2、药物筛选

二、已知蛋白检测核酸
01 CHIP
❖原理
染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation, CHIP）是一种用于研究体内蛋白质与DNA相互作用的实验技术。它通过使用甲醛等化学交联剂固定细胞或组织中的蛋白质与DNA，然后利用超声波或酶将染色质断裂成较小片段。通过特异性抗体富集与目标蛋白结合的DNA片段，进而通过qPCR、芯片或高通量测序技术（如ChIP-seq）进行分析。


❖技术特点
能够真实的反映细胞内蛋白质和DNA的结合情况；技术较为成熟；

❖实验步骤
1、交联固定：甲醛处理使蛋白和DNA交联；
2、染色质剪切：通过酶解法或者超声法对染色质进行剪切；
3、免疫沉淀：使用目标蛋白特异性抗体捕获和沉淀蛋白质-DNA复合物；
4、DNA纯化和检测：纯化得到DNA并进行下游qPCR或二代测序检测；

❖应用
1、转录因子结合位点分析；
2、组蛋白修饰研究；
3、基因表达调控研究；

02RIP
❖原理
和Co-IP技术类似，使用目标蛋白特异性抗体富集蛋白和RNA复合物，并对RNA进行纯化和检测的技术。


❖技术特点
能够真实的反映细胞内蛋白质和RNA的结合情况；实验操作简单；不需要特殊仪器

❖实验步骤
1、样品制备：细胞裂解释放蛋白；
2、免疫沉淀：ProteinA/G琼脂糖珠或者磁珠偶联抗体，然后加入细胞裂解液；
3、RNA纯化：对与目标蛋白结合的RNA进行纯化；
4、结果分析：qPCR或者测序鉴定RNA；

❖应用
1、RNA结合蛋白研究；
2、转录调控研究；

03 CUT&RUN，CUT&Tag
❖原理
CUT&RUN技术对细胞进行透化处理，使抗体能够进入细胞核并与目标蛋白结合，CUT&RUN技术通过pAG-MNase对目标染色质片段进行剪切并释放出细胞，而CUT-Tag技术则直接通过pAG-Tn5对目标染色质区域进行切割，并直接在序列两端连接接头，为后期二代测序建库节约时间和成本。


❖技术特点
和CHIP实验相比，CUT&RUN和CUT&Tag技术样品需求量更少，操作更加简单。直接在细胞中进行操作，不需要固定和超声，也更大限度的保存了蛋白和核酸的原始形态。CUT&Tag技术直接在序列两端连接接头，更适合后期进行二代测序分析。

❖实验步骤
CUT&RUN：
1、刀豆蛋白A固定结合细胞、洋地黄皂苷透化；
2、一抗募集靶向酶pAG-MNase到目标染色质区域；
3、pAG-MNase对靶向染色质片段的剪切；
4、DNA纯化&分析；

CUT&Tag：
1、刀豆蛋白A固定结合细胞、洋地黄皂苷透化；一抗、二抗和pAG-Tn5结合；
2、pAG-Tn5通过抗体被招募到目标染色质区域；
3、Tn5在Mg2+激活下切割并就地连接接头Adapter序列；
4、DNA 纯化&分析；

❖应用
1、组蛋白修饰分析
2、转录因子结合分析
3、转录辅因子研究

三、已知核酸检测蛋白
01 DNA/RNA Pull down
❖原理
DNA/RNA Pull down技术是通过生物素标记的DNA或者RNA探针先和Streptavidin琼脂糖珠/磁珠结合，再与细胞裂解液进行孵育，形成磁珠-核酸探针-蛋白复合物，再对蛋白进行洗脱和鉴定。


❖技术特点
能够真实的反映细胞内蛋白质和核酸的结合情况；实验操作简单；不需要特殊仪器。

❖实验步骤
1、探针固定：生物素标记的DNA探针和Streptavidin磁珠结合；
2、裂解液孵育：与细胞裂解液进行孵育，形成磁珠－DNA探针－蛋白复合物；
3、清洗和洗脱：洗涤去除非特异性结合的蛋白并对特异性蛋白进行洗脱和鉴定；

❖应用
1、转录因子研究
2、RNA结合蛋白研究
3、疾病相关蛋白研究

02 EMSA
❖ 原理
凝胶迁移实验（EMSA）是基于蛋白质-DNA复合物在非变性聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳中的迁移速度慢于自由DNA片段。使用核酸探针和样品蛋白孵育后，核酸如果和蛋白有相互作用，就会形成核酸-蛋白复合物，迁移速度会慢于游离的探针并形成一条滞后带，根据凝胶上滞后带的有无和多少来定量DNA结合蛋白的有无和结合活性。


❖技术特点
EMSA是一种简单、快速、可定性与定量的体外蛋白质与DNA相互作用检测方法，且适用于未经纯化的蛋白和纯化的重组蛋白。

❖实验步骤
1、探针标记：设计目标基因探针，上面带有生物素或者放射性标记标记，与蛋白裂解液或者纯化蛋白共同孵育；
2、EMSA电泳：探针-蛋白复合物进行EMSA电泳；
3、凝胶显影和分析：利用放射自显影或化学发光检测系统来检测和分析结果，观察蛋白-探针复合物的迁移情况

❖应用
1、基因表达转录调控；
2、转录因子或者RBP研究；

各种互作方法比较



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