干货满满-PCR原理及应用

营养师

在现代生物学中，PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一项必不可少的技术，它可以复制出大量的DNA片段，从而扩增了DNA的数量，为基因组研究和分子诊断提供了有力的工具。

01PCR的基本原理
PCR技术是利用聚合酶（polymerase）在体外模拟DNA复制的过程，通过不断的扩增，使得DNA的数量呈指数级增长。
PCR反应需要DNA模板, Primers（引物）, dNTPs（核苷酸）, PCR buffer（缓冲液）, DNA聚合酶等原料，PCR循环条件也是影响PCR实验结果的重要因素。



01
PCR模板可以是任何DNA来源，如基因组DNA（gDNA）、互补DNA（cDNA）和质粒DNA。不过，DNA的组成或复杂度会影响PCR扩增的最佳起始量。例如，在起始量为50 µL 的PCR中，只需0.1–1 ng质粒DNA，而gDNA则需要5–50 ng。最佳模板起始量还取决于所使用的 DNA 聚合酶类型；经过改造 的DNA聚合酶对模板的亲和力更强，灵敏度更高，所需的DNA起始量更少。对DNA起始量的优化很重要，因为起始量过高会增加发生非特异性扩增的风险，而起始量过低会降低得率。

02
Primers（引物）是含有15-30个碱基的合成DNA寡核苷酸。能够与模板DNA中目标区域的侧翼序列结合（通过序列互补）。在PCR反应期间，DNA聚合酶从 3′端开始延伸引物。因此，引物结合位点必须是靶标附近所特有的，并且与起始DNA的其它部分序列具有最小的同源性，以确保目的片段的特异性扩增。
除了序列同源性，引物还必须考虑到其它相关问题，以确保PCR扩增的特异性。引物序列的熔解温度（Tm）必须在 55–70°C之间，两种引物的 Tm相差不超过 5°C。同样重要的是，引物的序列不能具有互补性（特别是3’末端），若两个引物互补会促进退火（即，引物二聚体），自我互补会导致自我配对（即，二级结构），或序列的直接重复会导致与模板目标区域产生不完全配对。



03
dNTPs（核苷酸）由四个基本核苷酸组成——dATP、dCTP、dGTP和dTTP——是新DNA链的组成元件。
脱氧尿苷三磷酸（dUTP）替代dTTP，结合使用尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG）预处理，是PCR实验室防止残余PCR产物污染的重要手段。UDG是一种DNA修复酶，能够剪切含有尿嘧啶的DNA链。使用dUTP替代dTTP，会生成含有尿嘧啶的PCR产物。在开始PCR前，使用UDG孵育反应样品，能够去除含有尿嘧啶的污染性残余PCR产物，从而防止残余PCR产物引起假阳性结果。



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PCR buffer（缓冲液）能够为DNA聚合酶活性提供适宜的化学环境。缓冲液pH通常为8.0-9.5，一般使用Tris-HCl来调节。
镁离子（Mg2+）作为DNA聚合酶活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键（图 6）。此外， Mg2+ 能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷，从而促进引物与DNA模板形成复合物。
对于 Taq DNA 聚合酶，缓冲液的一个常见成分是来自KCl的钾离子（K+)，其可促进引物的吸附。有时，也可使用硫酸铵(NH4)2SO4 代替KCl。铵离子(NH4+) 具有去稳定作用，尤其对于错配引物-模板复合物碱基对之间的弱氢键，因此可增强反应特异性



Mg2+ 浓度过低会降低聚合酶活性，导致PCR产物较少或无PCR产物。另一方面， Mg2+ 浓度过高则会提高引物-模板复合物的稳定性，产生非特异性PCR产物，并增加由dNTP错误插入导致的复制错误。
由于NH4+ 与Mg2+具有拮抗效应，因此，在各种 Mg2+ 浓度下，含有(NH4)2SO4 的缓冲液都表现出更高的引物特异性。

05
DNA聚合酶是PCR的重要组成部分，它们能够从单链DNA模板合成新的互补链。所有DNA聚合酶都具有 5′→ 3′ 聚合酶活性，即掺入核苷酸并使引物从按5'至3’方向延伸。
非特异性扩增是PCR反应最主要的障碍之一，因为它会显著降低目的基因扩增的产率和灵敏度，从而影响扩增结果的合理解释和下游实验应用的成功。而DNA聚合酶经常会延伸错配的目的基因和引物二聚体，这是非特异性扩增的常见来源。
1994年，具有真正热启动特性的TaqDNA聚合酶问世，通过在室温下配制反应时将特异性抗体与聚合酶结合来抑制其活性。在初始高温变性步骤（如，>90℃）阶段，结合的抗体失活，从而激活DNA聚合酶。
变性步骤还可能分离反应配制过程中形成的错配序列和引物二聚体，从而防止它们在后续退火和延伸过程中被DNA聚合酶扩增。这样，热启动DNA聚合酶便可降低非特异性扩增，提高产率，可实现室温下配制反应体系，方便用于高通量实验应用。
作为抗体的替代物，通过对酶活性位点进行热不稳定化学修饰，或者使用适配子等小分子缩短活化时间，也能够获得热启动性能。无论是否选择热启动技术，在非加热条件下有效阻断DNA聚合酶活性，对确保特异性而言都至关重要。



最初来自于嗜热菌菌株的 Taq DNA 聚合酶可耐受相对较高的温度，但是其半衰期在90°C以上时明显缩短。当使用 长时间高温 使具有二级结构和富含GC序列的DNA变性时，这一缺陷便成为一大难题。同样，在扩增长片段模板时，需要更大量的Taq DNA 聚合酶或补充Taq DNA聚合酶，以供长时间孵育。因此，从超嗜热菌分离的DNA聚合酶具有更高的热稳定性，将有助于克服这些挑战。但它们在某些方面也具有一定局限性。例如，超耐热 Pfu DNA 聚合酶的合成能力较低（与 Taq DNA聚合酶相比），因此合成DNA的速度较慢。此外，古细菌DNA聚合酶无法扩增含有尿嘧啶的DNA模板，因为其存在尿嘧啶结合区域作为一种DNA修复机制。含尿嘧啶的DNA序列是防止PCR残余污染和经亚硫酸氢盐转化进行基因座甲基化分析的基础。
高保真DNA聚合酶就是具有强校正活性的酶。DNA聚合酶准确复制DNA序列（即获得无错误序列）的能力对分子克隆、测序和定点突变等实验应用至关重要。
其校正活性基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性，可校正错误插入的核苷酸。DNA聚合酶上的核酸外切酶活性位点与其5′→ 3′聚合酶活性位点是分离的。当错配的核苷酸插入聚合结构域，DNA合成将因不合适的碱基配对动力学而暂停。暂停期间，DNA聚合酶将切除错配的核苷酸并用正确的核苷酸替换。
合成能力高的DNA聚合酶适用于扩增长模板、具有二级结构和富含GC的序列，以及存在肝素、木聚糖和腐殖酸等PCR抑制剂的血液和植物组织样品。
早期的高保真DNA聚合酶具有较强的核酸外切酶活性，所以合成能力较低，且会减慢聚合速度。因此，其扩增较长目标DNA的速度明显减慢。例如，校正 Pfu DNA聚合酶的保真度是 Taq DNA聚合酶的7倍，但其合成率还不到 Taq聚合酶的一半。使用另一个蛋白质的强DNA结合域对DNA聚合酶进行改造后，实现了合成能力的突破，同时不影响聚合酶活性。这些改进型DNA聚合酶的合成能力提高了2-5倍。

06
PCR循环条件，PCR是一种能够在短时间内将单个DNA分子扩增数百万倍的生化过程，为扩增目标DNA，需重复（或“循环”）PCR的变性、退火和延伸步骤多次。
在PCR起始阶段，采用变性步骤将双链DNA模板解离成单链，从而使引物可与目标区域结合并开始延伸。起始DNA的完全变性，有助于确保在第一个扩增循环期间实现有效的目标序列扩增。此外，此步的高温条件有助于使样品中可能存在的热不稳定性蛋白酶或核酸酶失活，从而保证它们极小影响热稳定性DNA聚合酶。当使用热启动DNA聚合酶时，此步同时可以激活该聚合酶。起始变性步骤通常是在94–98°C下孵育1-3分钟。该步骤的时间和温度取决于模板DNA的性质和缓冲液的盐浓度。例如，哺乳动物基因组DNA可能比质粒和PCR产物需要更长的孵育时间（具体取决于DNA的复杂程度和大小）。同样，高GC含量（如， >65%）的DNA通常需要更长的孵育时间或更高的温度。高盐浓度的缓冲液（满足某些DNA聚合酶的需要）同样需要更高的变性温度（如，98°C），以使双链DNA解离。在95°C以上长时间孵育，很容易使 Taq DNA 聚合酶等DNA聚合酶变性。为弥补在该步骤中酶损失的活性，可能需要在起始变性步骤后添加更多的酶，或在一开始加入多于建议用量的DNA聚合酶。高度 热稳定的酶（如来自 Archaea 的酶）能够耐受长时间高温孵育，在整个PCR过程中保持活性。
引物退火是降低反应温度，使引物与目标DNA结合。如果结果为无扩增条带或扩增水平很低，则优化时应以2–3°C增量逐渐降低退火温度。但是，如果出现非特异性PCR产物，则以2–3°C增量逐渐提高温度（最高至延伸温度），提高特异性。
引物延伸是DNA聚合酶的5′→ 3′聚合酶活性引入dNTP并合成子链。反应温度升高至酶的最佳温度（热稳定DNA聚合酶的最佳温度通常为70–75°C），使其达到最高活性。如果引物退火温度与延伸温度相差不超过3°C，则退火和延伸温度可合并为一步，称为 两步PCR法，可取代传统的三步PCR法。两步PCR法无需在退火和延伸之间转换和稳定温度，从而缩短了PCR所需的时间。
Taq DNA 聚合酶的一般延伸时间是1分钟/kb，而 Pfu DNA 聚合酶为2分钟/kb。因此，“缓慢型”聚合酶比“快速型”聚合酶需要更多的扩增时间，才能获得相等的得率。同样，长DNA扩增子比短DNA需要更长的延伸时间，才能实现全长复制。当扩增长目的片段（如， >10 kb）时，除了需要增加延伸时间，还需要降低PCR温度，以确保引物结合并在长时间循环中维持酶活性。
循环数具体取决于DNA起始量和所需的目标PCR产物得率。循环数通常为25-35次，具体取决于DNA起始量和所需的目标PCR产物得率。如果DNA起始量少于10拷贝数，则可能需要多达40个循环，才可获得足够的得率。不建议使用超过45个循环，因为过多的循环数会产生非特异性条带。而且，副产物的累积和反应组分的消耗会大大降低PCR效率，使PCR扩增曲线出现平台期。相反，较少的循环数更适合于无偏倚扩增（如下一代测序）以及目标DNA的准确复制（如克隆）。



02 PCR在实验中的应用
PCR技术已经广泛应用于基因组研究、分子诊断、基因工程、种群遗传学等领域。其中，常见的应用包括：
DNA测序：PCR扩增可以提供足够的DNA量进行测序，从而帮助人们了解DNA序列的结构和功能。
基因分型：PCR扩增可以扩增出目标基因的特定片段，从而进行基因分型和分析。
基因克隆：PCR扩增可以扩增出目标基因的全长或部分序列，从而进行基因克隆和表达。
病原体检测：PCR扩增可以扩增出病原体DNA的特异性序列，从而进行病原体检测和诊断。
总之，PCR技术是一种快速、高效、灵敏、特异的DNA扩增技术，已经成为现代生物学研究和分子诊断的必备技术。
目前，PCR技术已经广泛应用于科学研究和医学诊断领域，成为分子生物学和医学领域的重要工具。随着生物技术和医学的不断发展，PCR技术也在不断进化和改进，主要包括以下几个方面：
数字PCR技术：数字PCR技术是PCR技术的一种改进，可以通过将扩增产物分割成数以千计的小区域来进行扩增，从而提高PCR反应的精度和灵敏度，特别适用于稀有突变的检测和定量。
实时定量PCR技术：实时定量PCR技术是一种通过检测PCR反应过程中荧光信号的变化来实现DNA定量的方法，可以实现快速、准确、灵敏的DNA定量分析，特别适用于基因表达和病原体检测等领域。
微流控PCR技术：微流控PCR技术是一种通过将PCR反应微型化来实现PCR反应的高通量、低成本和快速的方法，特别适用于基因表达和病原体检测等领域。
PCR技术在生物技术和医学领域的应用前景广阔，不断的技术创新和改进将进一步推动PCR技术的发展和应用，为人类健康和生命科学研究提供更加强大的工具和技术支持。

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